Metabolit imunomodulator iami antu fitur kunci ri lingkungang mikro tumor (TME), mingka siagang sike'de' pengecualian, identitasna anre'pa na ni isse'. Anrinni, kiparessai tumor siagang sel T battu ri tumor siagang ascites pasienna karsinoma serous tinggi (HGSC) untuk ampa'nyatai metabolom kompartemen TME yang berbeda. Ascites siagang sel tumor nia sisalana metabolit yang luas. Punna nipasibandingi siagang ascites, sel T infiltrasi tumor signifikan ni pakaya ri 1-methylnicotinamide (MNA). Manna pole tingka MNA ri sel T tinggi, ekspresi nikotinamida N-metiltransferase (enzim yang mengkatalisis transfer kelompok metil dari S-adenosylmetionine ke nikotinamida) terbatas ri fibroblas siagang sel tumor. Secara fungsional, MNA menginduksi sel T untuk mengeluarkan faktor nekrosis tumor sitokin promotor tumor alfa. Jari, TME-derived MNA berkontribusi ri regulasi kekebalan sel T siagang a'jari target imunoterapi potensial untuk pa'balle kanker rupa tau.
Metabolit yang berasal dari tumor dapat memiliki efek penghambat mendalam pada kekebalan anti-tumor, dan lebih banyak bukti menunjukkan bahwa mereka juga dapat menjadi kekuatan pendorong kunci untuk perkembangan penyakit (1). Ri ta'gala'na efek Warburg, jama-jamang beru-berua anne appakkaramulami a'pa'nassa keadaang metabolisme sel tumor siagang hubunganna siagang keadaang kekebalan lingkungan mikro tumor (TME). Studi ri modele tikus siagang sel T rupa tau ampa'piitteangi angkua metabolisme glutamin (2), metabolisme oksidatif (3) siagang metabolisme glukosa (4) akkullei anjama secara independen ri subkelompok sel imun. Sipa'gang metabolit ri jalur-jalur anne anghalangi fungsi anti-tumor sel T. Lebba'mi ni buktikan angkua blokade koenzim tetrahidrobiopterin (BH4) akkullei ancuruki proliferasi sel T, siagang pa'naikanna BH4 ri tubua akkullei na pa'nassa tanggapang imun anti-tumor ni mediasi ri CD4 siagang CD8. Nampa pole, efek imunosupresif kynurenine akkullei nipasalama siagang pa'sareang BH4 (5). Ri glioblastoma mutan isocitrate dehydrogenase (IDH), sekresi enantiometabolic (R)-2-hidroksiglutarat (R-2-HG) antahangi aktivasi sel T, proliferasi siagang Aktivitas sitolisis (6). Anne kamma-kamma anne, nipa'piitteangmi angkua metilglioksal, produk sampingan glikolisis, ni pa'jari ri sel penekan asal myeloid, siagang transfer sel T metilglioksal akkullei anghalangi fungsi sel T efektor. Ri pa'balle, netralisasi metilglioksal akkullei nabeta aktivitas sel penekan berasal dari myeloid (MDSC) siagang sinergis na pa'nassa terapi blokade pos pemeriksaan ri model tikus (7). Anne pa'pilajaranga massing-massing napaentengi peran kunci metabolit battu ri TME ri laleng angngatoro fungsi siagang aktivitas sel T.
Disfungsi sel T lebba ni laporo ri kanker ovarium (8). anne se're bageang nasaba sipa' metabolisme niaka ri hipoksia siagang pembuluh darah tumor abnormal (9), na anjari konversi glukosa siagang triptofan a'jari produk sampingan sangkamma asam laktat siagang kynurenine. Laktat ekstraseluler berlebihan nakurangi produksi interferon-γ (IFN-γ) siagang na dorong diferensiasi subkelompok myelosuppressive (10, 11). Konsumsi triptofan secara langsung menghambat proliferasi sel T siagang menghambat sinyal reseptor sel T (12-14). Manna pole anjo pa'paressa, jai jama-jamang ri sesena metabolisme imun nigaukangi ri kultur sel T in vitro ammake media optimal, iareka ni batasi ri modele tikus homolog in vivo, manna se're tania' ampa'piitteang sukku' heterogenitas kanker rupa tau siagang lingkungang makro siagang mikro fisiologis.
Sipa' umum kanker ovarium iamintu pa'la'bang peritoneum siagang ammumbana ascites. Pa'rappungang cairang sel ri ascites ni pasisambungangi siagang garring lompo siagang prognosis kodi (15). Situru laporang, anne kompartemen unik iami antu hipoksik, nia tinggina faktor pertumbuhan endotel vaskular (VEGF) siagang indoleamin 2,3-dioksigenase (IDO), siagang ni infiltrasi ri sel pengatur T siagang sel penghambat mieloid (15-18). Lingkungan metabolisme asma akkullei assisalai siagang tumor, jari pemrograman ulang sel T ri ruang peritoneum tena natangkasa. Nampa pole, sisalana kunci siagang heterogenitas ascites siagang metabolit niaka ri lingkungang tumor akkullei anghalangi infiltrasi sel imun siagang fungsina ri tumor, siagang parallui nigaukang penelitiang lanjutang.
Untu' ampa'le'baki anne passalaka, a'rancang maki' se're metode pemisahan sel sensitif siagang kromatografi cair spektrometri massa tandem (LC-MS/MS) untu' amparessai rupa-rupaya sel (pantama' tongi sel T CD4 + siagang CD8 +) kammayatompa lalang siagang ri alla'na tumor Metabolitna antama' ri sel-sel ri lingkungang ascites siagang tumor pasienna. Ikatte ampakei anne caraya ri sesena sitometri aliran tinggi dimensi siagang sekuensing RNA sel tunggal (scRNA-seq) untuk assarei gambarang tinggi ri sesena status metabolisme populasi kunci anne. Anne caraya ampa'piitteangi pa'naikanna signifikan ri tingka' 1-metilnikotinamida (MNA) ri sel T tumor, siagang paccoba in vitro ampa'piitteangi angkua efek imunomodulator MNA ri fungsi sel T riolo tenapa na ni isse'. Secara umum, anne caraya ampa'nyatai interaksi metabolisme timbal balik antara tumor siagang sel imun, siagang assarei wawasan unik ri metabolit regulasi imun, yang mungkin berguna untuk pengobatan kanker ovarium berbasis sel T peluang pengobatan imunoterapi.
Ikatte ampakei sitometri aliran tinggi dimensi untuk sikali-kali angngukuri pengambilan glukosa [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) siagang aktivitas mitokondria [MitoTracker Deep Red (MT DR)) (2019, 2019) ri samping penanda khas yang membedakan sel imun dan populasi sel tumor (Tabel S2 dan Gambar S1A). Analisis anne ampa'piitteangi angkua punna nipasibandingi siagang sel T, ascites siagang sel tumor nia' tingka' pengambilan glukosa tinggi, mingka nia' perbedaang ca'di ri aktivitas mitokondria. Rata-rata pengambilan glukosa sel tumor [CD45-EpCAM (EpCAM)+] iamintu tallu sa'genna appa' kali lipat battu ri sel T, siagang rata-rata pengambilan glukosa sel CD4 + T iamintu 1,2 kali lipat battu ri sel CD8 + T, iaminjo a'nassai angkanaya limfosit infiltrasi tumor (TIL) nia' persyaratan metabolisme maraeng manna pole ri TAME sangkamma (Gambar 1). Sikontutojenna, aktivitas mitokondria ri sel tumor sangkammai siagang sel CD4 + T, siagang aktivitas mitokondria ri ruaya jenis sel labbi tinggi na sel CD8 + T (Gambara 1B). Secara umum, anne hasilna ampa'piitteangi tingka' metabolisme. Aktivitas metabolisme sel tumor labbi tinggi na sel CD4 + T, siagang aktivitas metabolisme sel CD4 + T labbi tinggi na sel CD8 + T. Manna pole anjo efek-efek ri sikuntuna jenis sel, tena sisalana konsisten ri status metabolisme CD4 + siagang CD8 + T sel atau proporsi relatifna ri ascites nibandingkan siagang tumor (Gambara 1C). Sikontutojenna, ri fraksi sel CD45, proporsi sel EpCAM+ ri tumor nai' punna nipasibandingi siagang ascites (Gambara 1D). Ikatte to'ji anciniki sisalana metabolisme yang je'ne' ri EpCAM+ siagang EpCAM- komponen sel. Sel EpCAM+ (tumor) nia tinggina pengambilan glukosa siagang aktivitas mitokondria na sel EpCAM-, yang tinggiangngangi na aktivitas metabolisme fibroblas ri sel tumor ri TME (Gambara 1, E siagang F).
(A siagang B) Intensitas fluoresensi median (MFI) pengambilan glukosa (2-NBDG) (A) siagang aktivitas mitokondria sel CD4 + T (MitoTracker merah gelap) (B) Grafik representatif (kiri) siagang data tabulasi (Kanan), sel CD8 + T siagang EpCAM + CD45-sel tumor battu ri tumor siagang tumor. (C) Rasio sel CD4 + siagang CD8 + (sel CD3 + T) ri asma siagang tumor. (D) Proporsi EpCAM + sel tumor ri asma siagang tumor (CD45−). (E siagang F) EpCAM + CD45-tumor siagang EpCAM-CD45-matrix glukosa uptake (2-NBDG) (E) siagang aktivitas mitokondria (MitoTracker dark red) (F) grafik representatif (kiri) siagang data tabulasi (Kanan) Ascites siagang sel tumor. (G) Grafik perwakilan ekspresi CD25, CD137 siagang PD1 ri sitometri aliran. (H siagang I) CD25, CD137 siagang PD1 ekspresi ri CD4 + sel T (H) siagang CD8 + sel T (I). (J siagang K) Naif, memori pusat (Tcm), efektor (Teff) siagang memori efektor (Tem) fenotipe berdasarkan ekspresi CCR7 siagang CD45RO. Gambar representatif (kiri) siagang data tabular (kanan) sel CD4 + T (J) siagang sel CD8 + T (K) ri asma siagang tumor. Nilai P nitentukan siagang t-test berpasangan (*P<0,05, **P<0,01 siagang ***P<0,001). Garis a'wakilkan pasien yang cocok (n = 6). FMO, fluoresensi kurang se're; MFI, intensitas fluoresensi median.
Analisis lanjutang napa'piitteang sisalana signifikan maraeng ri alla'na status fenotipik sel T yang tinggi resolusi. Memori aktif (Gambara 1, G mange ri I) siagang memori efektor (Gambara 1, J siagang K) ri tumor sanna' jaina na ascites (proporsi sel CD3 + T). Kammayatompa, ansalidiki fenotipe siagang ekspresi penanda aktivasi (CD25 siagang CD137) siagang penanda depletion [protein kematian sel terprogram 1 (PD1)] ampa'piitteangi angkanaya manna pole sipa' metabolisme populasi anne assisalai (Gambara S1, B sa'genna E), mingka tena perbedaan metabolisme signifikan ni cini' secara konsisten ri alla'na efek memori naif, yareka subset (Gambara S1, F1 NAKKE). Anne wassele'na ni konfirmasi siagang ammake metode pembelajaran mesin untuk otomatis a'paenteng fenotipe sel (21), yang lebih lanjut mengungkapkan kehadiran sel sumsum tulang yang banyak (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) di ascites pasien (Gambar S2A). Ri tangnga-tangngana sikontu rupanna sel ni identifikasi, populasi sel myeloid anne ampa'piitteangi pengambilan glukosa siagang aktivitas mitokondria kaminang tinggi (Gambara S2, B sa'genna G). Anne wassele'na ampa'nassai sisalana metabolisme kuat ri tangnga-tangngana rupanna sel ni gappa ri ascites siagang tumor ri pasien HGSC.
Tantangan utama ri laleng ampahangi sipa' metabolomik TIL iamintu parallui ni isolasi sampel sel T sukku' murni, kualitas siagang kuantitas battu ri tumor. Studi beru-berua ampa'piitteangi angkua cara pa'pilajarang siagang pa'pilajarang manik-manik situru' sitometri aliran akkullei a'jari pa'pinraang ri profil metabolit seluler (22-24). Untu' angngewai anne masala, kipa'optimalkanngi metode pengayaan manik-manik untu' angisolasi siagang angisolasi TIL battu ri kanker ovarium tau ni reseksi secara bedah riolo analisis ri LC-MS/MS (ciniki Bahan siagang Cara; Gambar 2A). Untu' ansalidiki dampakna anne protokol ri sesena pa'pinraang metabolit, nibandingkangi profil metabolit sel T ni aktifkan ri donor sehat ribokoangna langkah pemisahan manik-manik ri dallekang siagang sel-sel yang tena na nipisangkai manik-manik mingka ammantang ri es. Analisis kontrol kualitas anne nabuntulu angkua rie' korelasi tinggi ri tangnga-tangngana anne ruaya kondisi (r = 0,77), siagang pengulangan teknis kelompok 86 metabolit tinggi pengulangan (Gambara 2B). Jari, anne cara-caraya akkullei anggaukangi analisis metabolit yang akurat ri sel-sel yang menjalani pengayaan tipe sel, sehingga menyediakan platform resolusi tinggi pertama untuk mengidentifikasi metabolit-metabolit tertentu di HGSC, sehingga memungkinkan orang-orang untuk mendapatkan pemahaman yang lebih dalam tentang spesifisitas sel Program metabolisme seksual.
(A) Diagram skematik pengayaan manik magnetik. Riolo analisis ri LC-MS/MS, sel-selna la'lampai tallu putarang berturut-turut pengayaan manik magnetik iareka ammantang ri es. (B) Efek jenis pengayaan pada kelimpahan metabolit. Rata-rata tallu pengukuran untuk massing-massing jenis pengayaan ± SE. Garis abu-abu a'wakilkan hubungang 1:1. Korelasi intra-kelas (ICC) pengukuran berulang ni pa'piitteang ri label sumbu. NAD, nikotinamida adenin dinukleotida. (C) Diagram skematik alur kerja analisis metabolit pasien. Ascites atau tumor niallei battu ri pasienna siagang nilestarikan. Sipagang ca'di battu ri massing-massing sampel ni analisisi siagang flow cytometry, nampa sampel sisa'la'na ni allei tallu putarang pengayaan untuk sel CD4+, CD8+ siagang CD45-. Anne fraksi sel ni analisisi siagang LC-MS/MS. (D) Peta panas battu ri kelimpahan metabolit standar. Dendrogram a'wakilkangi pa'rappungang ward battu ri jarak euclidean ri alla'na sampel. (E) Analisis komponen utama (PCA) peta metabolit sampel, ampa'piitteang tallu replika battu ri massing-massing sampel, sampel battu ri pasien yang sama ni sambungkan ri garisi. (F) PCA profil metabolit sampel ni kondisikan ri pasien (iamintu, ammake redundansi parsial); jenis sampel ni batasi ri lambung cembung. PC1, komponen utama 1; PC2, komponen utama 2.
Nampa, nipakei anne cara pa'paentengang untu' ansalidiki 99 metabolit ri CD4 +, CD8 + siagang CD45-sel fraksi ri ascites primer siagang tumor annang pasien HGSC (Gambara 2C, Gambara S3A siagang Tabel S3 siagang S4). Populasi yang diminati menyumbang 2% hingga 70% dari sampel besar asli sel hidup, dan proporsi sel sangat bervariasi antara pasien. Punna lebaki ni pasisa'la' manik-manik, fraksi yang diperkaya (CD4+, CD8+ atau CD45-) a'jari labbi 85% battu ri sikontu sel attallasaka ri sampel rata-rata. Metode pengayaan anne akkullei nipake untu' analisis populasi sel battu ri metabolisme jaringan tumor rupataua, ia tenaya nakkulle nigaukang battu ri sampel lompo. Pake anne protokol, kipattentui angkanaya l-kynurenine siagang adenosine, anne ruaya metabolit imunosupresif niaka tanra baji’na niangkaki ri sel T tumor yareka sel tumor (Gambara S3, B siagang C). Jari, anne wassele'na ampa'piitteangi kasatiaang siagang pakkullena teknologi pemisahan sel siagang spektrometri massa untu' anrapikang metabolit penting secara biologis ri jaringan pasien.
Analisis ikatte ampa'piitteang tongi pa'bageang metabolisme kuat ri sesena sel ri tangnga-tangngana siagang ri alla'na pasien (Gambara 2D siagang Gambara S4A). Khususna, punna nipasibandingi siagang pasien maraeng, pasien 70 ampa'piitteang sipa' metabolisme maraeng (Gambara 2E siagang Gambar S4B), a'nassai angkua rie' heterogenitas metabolisme substansial ri tangnga-tangngana pasien. Parallui ni issengi punna nipasibandingi siagang pasien maraeng (1,2 sa'genna 2 liter; Tabel S1), sanna' jaina ascites ni pa'rappungang ri pasien 70 (80 ml) labbi ca'di. Kontrol heterogenitas antar-pasien ri wattu analisis komponen poko' (ebara'na, ammake analisis redundansi parsial) ampa'piitteangi pa'pinraang konsisten ri alla'na rupanna sel, siagang rupanna sel siagang/yareka lingkungang mikro je'ne' a'rappungang situru' profil metabolit (Gambara 2F). Analisis metabolit tunggal na paentengi anne efek-efek siagang na pa'piitteang sisalana signifikan antara jenis sel siagang lingkungan mikro. Parallui ni issengi angkua sisalana kaminang ekstrim ni cini' iamintu MNA, yang biasana ni pa'gannaki ri sel CD45- siagang ri sel CD4+ siagang CD8+ yang antama ri tumor (Gambara 3A). Untuk sel CD4 +, anne efek kaminang singara, siagang MNA ri sel CD8 + sanna tongi ni pengaruhi ri lingkungang. Mingka, anne teai parallu, nasaba talluji battu ri annang pasien akkulle ni evaluasi untuk skor CD8+ tumor. Ri tambanganna MNA, ri rupa-rupaya sel ri ascites siagang tumor, metabolit maraeng yang kurang ni cirikan ri TIL sanna tongi kayana (Gambara S3 siagang S4). Jari, anne dataya ampa'nyatai se're set metabolit imunomodulator yang menjanjikan untuk penelitian lanjutan.
(A) Kandungan MNA yang dinormalkan di CD4+, CD8+ dan CD45- sel dari ascites dan tumor. Plot kotak ampa'piitteangi median (garis), rentang antarkuartil (engsel bingkai) siagang rentang data, sanggenna 1,5 kali rentang antarkuartil (kumis bingkai). Sangkamma ni carita ri bahan siagang cara pasien, pakei nilai limma pasien untuk ampattantui nilai P (*P<0.05 siagang **P<0.01). (B) Diagram skematik metabolisme MNA (60). Metabolit: S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homocysteine; NA, nikotinamida; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-metil- 2-piridon-5-karboksamida; 4-PY, 1-metil-4-piridon-5-karboksamida; NR, nikotinamida ribosa; NMN, nikotinamida mononukleotida. Enzim (ijo): NNMT, nikotinamida N-metiltransferase; SIRT, sirtuins; NAMPT, nikotinamida fosforibosil transferase; AOX1, aldehida oksidase 1; NRK, nikotinamida ribosida kinase; NMNAT, nikotinamida mono Nukleotida adenilat transferase; Pnp1, purin nukleosida fosforilase. (C) t-SNE scRNA-seq ascites (abu-abu) siagang tumor (merah; n = 3 pasien). (D) Ekspresi NNMT ri populasi sel yang berbeda ni identifikasi menggunakan scRNA-seq. (E) Ekspresi NNMT siagang AOX1 ri SK-OV-3, ginjal embrionik manusia (HEK) 293T, sel T siagang sel T nirawat MNA. Ekspresi lipat ni pa'piitteang relatif mange ri SK-OV-3. Pola ekspresi siagang SEM ni pa'piitteang (n = 6 donor sehat). Nilai Ct lompoangngang na 35 ni anggappai tena nakkulle nideteksi (UD). (F) Ekspresi SLC22A1 siagang SLC22A2 ri SK-OV-3, HEK293T, sel T siagang sel T nirawat siagang 8mM MNA. Ekspresi lipat ni pa'piitteang relatif mange ri SK-OV-3. Pola ekspresi siagang SEM ni pa'piitteang (n = 6 donor sehat). Nilai Ct lompoangngang na 35 ni anggappai tena nakkulle nideteksi (UD). (G) Kandungan MNA sel ri sel T donor sehat yang diaktifkan setelah 72 jam inkubasi dengan MNA. Pola ekspresi siagang SEM ni pa'piitteang (n = 4 donor sehat).
MNA ni paentengi siagang aletteki gugus metil battu ri S-adenosyl-1-metionine (SAM) mange ri nikotinamida (NA) ri nikotinamida N-metiltransferase (NNMT; gambara 3B). NNMT ni ekspresikan secara berlebihan ri sangkamma kanker rupatau siagang ni kaitkangi siagang proliferasi, invasi siagang metastasis (25-27). Untu' ampahangi baji'-baji' assala'na MNA ri sel T ri TME, nipakei scRNA-seq untu' ampa'nassai ekspresi NNMT ri sikontu rupanna sel ri ascites siagang tumor tallu pasien HGSC (Tabel S5). Analisis kira-kira 6.500 sel ampa'piitteangi angkua ri lingkungang asma siagang tumor, ekspresi NNMT ni batasi ri populasi sel fibroblas siagang tumor yang ni anggappa (Gambara 3, C siagang D). Parallui ni issengi angkua tena ekspresi NNMT yang jelas ri populasi yang mengekspresikan PTPRC (CD45 +) (Gambara 3D siagang Gambar S5A), yang menunjukkan bahwa MNA yang dideteksi dalam spektrum metabolit telah dimasukkan ke sel T. Ekspresi aldehida oksidase 1 (AOX1) napinra MNA anjari 1-metil-2-piridon-5-karboksamida (2-PYR) atau 1-metil-4-piridon-5-karboksamida (4-PYR); Gambar 3B) ni batasi tongi ri populasi fibroblas yang mengekspresikan COL1A1 (Gambar S5A), yang bersama-sama menunjukkan bahwa sel T kurang kemampuan metabolisme MNA konvensional. Pola ekspresi gen-gen terkait MNA ini diverifikasi menggunakan set data sel independen kedua dari ascites dari pasien HGSC (Gambar S5B; n = 6) (16). Nampa pole, analisis reaksi berantai polimerase kuantitatif (qPCR) sel T donor sehat nirawat siagang MNA ampa'piitteangi angkanaya punna nipasibandingi siagang sel tumor ovarium SK-OV-3 kontrol, NNMT atau AOX1 sanna' tena na ni ekspresikan (Gambara 3E). Hasil yang tidak terduga ini menunjukkan bahwa MNA dapat disekresikan dari fibroblas atau tumor ke sel T yang berdekatan di TME.
Manna pole kandidatna antama tongi kaluarga transporter kation organik 1 sa'genna 3 (OCT1, OCT2 siagang OCT3) ni kode ri kaluarga pembawa larut 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 siagang SLC22A3), transporter potensial MNA anre'pa na ni definisikan (28) . QPCR mRNA battu ri sel T donor sehat ampa'piitteangi tingka' ekspresi SLC22A1 rannu mingka tingka' SLC22A2 tenaya nakkulle nideteksi, ia ampa'nassai angkanaya le'ba'mi nilaporo' riolo ri sastra (Gambara 3F) (29). Sikontutojenna, garisi sel tumor ovarium SK-OV-3 napappicinikangi tingka tinggina ruaya transporter (Gambara 3F).
Untu' angnguji kasampatang sel T akkullei na serap MNA asing, sel T donor sehat nikultivasi 72 jam ri dallekanna konsentrasi MNA yang berbeda. Punna tena MNA eksogen, konten seluler MNA takkulleai nideteksi (Gambara 3G). Mingka, sel T aktif nirawat siagang MNA eksogen napappicinikangi peningkatan dosis-dependen ri kandungan MNA ri sel-sel, sanggenna 6 mM MNA (Gambara 3G). Anne wassele'na ampa'nassai angkua manna pole ekspresi transporter sanna' tunana siagang kurangna enzim utama yang bertanggung jawab ri metabolisme MNA intraseluler, TIL akkulleiji angngalle MNA.
Spektrum metabolit ri sel T pasien siagang percobaan penyerapan MNA in vitro natambai kasampatang fibroblas terkait kanker (CAF) a'sekresi MNA siagang sel tumor akkullei angngatoro fenotipe siagang fungsi TIL. Untu' ampattantui wassele'na MNA ri sel T, sel T donor sehat ni aktifkan in vitro ri nia'na iareka tena MNA, siagang proliferasi siagang produksi sitokinna ni evaluasi. Punna lebaki 7 allo nitambai MNA ri dosis kaminang tinggi, nomoro ganda populasi sanna' kurangna, nampa kagassingang ni paenteng ri sikontu dosis (Gambara 4A). Nampa pole, pa'balle MNA eksogen a'kulle a'pa'nassa proporsi CD4 + siagang CD8 + sel T nu'pa'piitteang faktor nekrosis tumor-α (TNFα; Gambar 4B). Sikontutojenna, produksi intraseluler IFN-γ sanna' ni kurangi ri CD4 + T sel, mingka tena ri CD8 + T sel, siagang tena signifikan nipinra ri interleukin 2 (IL-2; Gambar 4, C siagang D). Jari, enzim-linked immunosorbent assay (ELISA) supernatan battu ri kultur sel T nirawat MNA anne ampa'piitteangi pa'naikanna TNFα, panra'na IFN-γ, siagang tena pa'pinraang ri IL-2 (Gambara 4, E mange ri G). . Panra'na IFN-γ a'nassai angkua MNA akkullei a'peran ri laleng antahangi aktivitas anti-tumor sel T. Untu' ansimulasikan efek MNA ri sitotoksisitas yang dimediasi sel T, sel reseptor antigen chimeric T (FRα-CAR-T) yang menargetkan reseptor folat α dan CAR-T (GFP) yang diatur oleh sel protein fluoresen hijau (GFP) -CAR-T) diproduksi oleh sel mononuklear darah perifer donor sehat (PBMC). Sel CAR-T nikultivasi 24 jam ri dallekanna MNA, nampa nikultivasi siagang sel tumor ovarium SK-OV-3 tau ampa'nyatai reseptor folat α ri rasio efektor mange ri target 10:1. Perawatan MNA a'jari panra'na signifikan ri aktivitas pammunoang sel FRα-CAR-T, ia sangkamma sel FRα-CAR-T nirawatang siagang adenosin (Gambara 4H).
(A) Jumlah sel layak total dan populasi penggandaan (PD) langsung dari kultur pada hari 7. Grafik batang mewakili rata-rata + SEM dari enam donor sehat. Nawakili data battu ri n = 3 paccoba independen. (B mange ri D) CD3/CD28 siagang IL-2 nipakei untu' ampa'jari aktif sel T ri konsentrasi MNA massing-massing lalang 7 allo. Riolo analisis, sel-sel ni rangsang siagang PMA/ionomycin siagang GolgiStop 4 jam. TNFα (B) ekspresi ri sel T. Conto gambara (kiri) siagang data tabular (kanan) ekspresi TNFα ri sel-sel attallasaka. IFN-γ (C) siagang IL-2 (D) ekspresi ri sel T. Ekspresi sitokin ni ukkuru siagang sitometri aliran. Grafik batang a'wakilkan rata-rata (n = 6 donor sehat) + SEM. Pakei analisis varians searah siagang pengukuran berulang (*P<0.05 siagang **P<0.01) untuk ampattantui nilai P. Nawakili data battu ri n = 3 paccoba independen. (E mange ri G) CD3/CD28 siagang IL-2 nipakei untu' ampa'jari aktif sel T ri konsentrasi MNA massing-massing lalang 7 allo. Media ni pa'rappungang riolo siagang ribokoangna 4 jam stimulasi PMA/ionomycin. Konsentrasi TNFα (E), IFN-γ (F) siagang IL-2 (G) ni ukkuru siagang ELISA. Grafik batang a'wakilkan rata-rata (n = 5 donor sehat) + SEM. Nilai P ni tentukan siagang analisis varians searah siagang pengukuran berulang (*P<0.05). Garis titik-titik a'pa'piitteang batas deteksi deteksi. (H) Assay lisis sel. FRα-CAR-T atau GFP-CAR-T sel disesuaikan dengan adenosin (250μM) atau MNA (10 mM) selama 24 jam, atau tidak dirawat (Ctrl). Persentase pammunoang sel SK-OV-3 ni ukkuru. Nilai P ni tentukan ri uji t Welch (*P<0.5 siagang **P<0.01).
Untu' anggappa pahang mekanistik ri sesena pangatorang ekspresi TNFα ta'ganttung ri MNA, pa'pinraang mRNA TNFα sel T nirawat MNA ni evaluasi (Gambara 5A). Sel T donor sehat nirawat siagang MNA ampa'piitteangi pa'naikanna rua kali lipat ri tingka' transkripsi TNFα, a'nassai angkua MNA ta'ganttung ri regulasi transkripsi TNFα. Untu' ansalidiki mekanisme pengaturan yang mungkin, rua faktor transkripsi yang diketahui yang mengatur TNFα, yaitu faktor nuklir sel T aktif (NFAT) dan protein spesifik 1 (Sp1), dievaluasi sebagai tanggapan MNA mengikat promotor TNFα proksimal ( 30). Promotor TNFα nia 6 situs pengikatan NFAT yang diidentifikasi dan 2 situs pengikatan Sp1, tumpang tindih di satu situs [-55 pasangan basa (bp) dari 5'cap] (30). Imunopresipitasi kromatin (ChIP) ampa'piitteangi punna nirawatang siagang MNA, pa'sambungang Sp1 mange ri promotor TNFα natambai tallu kali lipat. Pa'gabunganna NFAT natambai tongi siagang a'reppese'mi ri pentingna (Gambara 5B). Anne dataya ampa'nassai angkua MNA angngatoro ekspresi TNFα ilalang transkripsi Sp1, siagang ekspresi NFAT.
(A) Nibandingkangi siagang sel T nikultivasi tena MNA, lipatan perubahan ekspresi TNFα ri sel T nirawat siagang MNA. Pola ekspresi siagang SEM ni pa'piitteang (n = 5 donor sehat). Nawakili data battu ri n = 3 paccoba independen. (B) Promotor TNFα sel T nirawat siagang atau tena 8 mM MNA ribokoangna NFAT siagang Sp1 ni gaukangi siagang (Ctrl) siagang stimulasi PMA/ionomycin selama 4 jam. Imunoglobulin G (IgG) siagang H3 nipakei salaku kontrol negatif siagang positif untuk imunopresipitasi, massing-massing. Kuantifikasi ChIP ampa'piitteangi angkua pa'sambungang Sp1 siagang NFAT mange ri promotor TNFα ri sel-sel nirawat MNA natambai pirangalloang punna nipasibandingi siagang kontrol. Nawakili data battu ri n = 3 paccoba independen. Nilai P ni tentukan ri t-test (*** P <0.01). (C) Nibandingkan siagang asma HGSC, sel T (non-sitotoksik) ampa'piitteang ekspresi TNF ri tumor. Warna-warnaya a'wakilkan pasien yang berbeda. Sel-sel ni pa'piitteang ni sampel secara acak mange ri 300 siagang ni jitter untuk ambatasi overdrawing (** Padj = 0.0076). (D) Model MNA yang diusulkan untuk kanker ovarium. MNA ni paentengi ri sel tumor siagang fibroblas ri TME siagang niallei ri sel T. MNA natambai ikatanna Sp1 mange ri promotor TNFα, na anjari natambai transkripsi TNFα siagang produksi sitokin TNFα. MNA to'ji a'jari saba' na'kurang IFN-γ. Inhibisi fungsi sel T a'jari saba' na kurangi pakkullena ambunoi siagang a'jari pila' gassing tumor.
Situru laporang, TNFα nia efek anti-tumor siagang anti-tumor yang tagantung ri dallekang siagang ri boko, mingka nia peranna yang terkenal ri laleng ampa'bakka'i siagang metastasis kanker ovarium (31-33). Situru laporang, konsentrasi TNFα ri asma siagang jaringan tumor ri pasien kanker ovarium labbi tinggi na jaringan jinak (34-36). Ri sesena mekanisme, TNFα akkullei angngatoro aktivasi, fungsi siagang proliferasi sel darah pute, siagang a'pinra fenotipe sel kanker (37, 38). Situru siagang anne pa'pauang, analisis ekspresi gen diferensial ampa'piitteangi angkua TNF signifikan ni atoroki ri sel T ri jaringan tumor nibandingkan siagang ascites (Gambara 5C). Peningkatan ekspresi TNF hanya terlihat pada populasi sel T dengan fenotipe non-sitotoksik (Gambar S5A). Ri pa'pau singkamma, anne dataya na dukungi pa'pahang angkua MNA nia' rua imunosupresif siagang efek promosi tumor ri HGSC.
Pelabelan fluoresen berdasarkan sitometri aliran telah menjadi metode utama untuk mempelajari metabolisme TIL. Anne pa'pilajaranga ampa'piitteangi angkua punna nipasibandingi siagang limfosit darah perifer iareka sel T battu ri organ limfoid sekunder, TIL murine siagang rupataua nia' kecenderungan tinggi untu' angngalle glukosa (4, 39) siagang rugi bertahap fungsi mitokondria (19, 40). Manna pole rie'mo kicini' wassele' sangkamma ri anne pa'pilajaranga, pa'bakka'na poko'na iamintu a'bandingkangi metabolisme sel tumor siagang TIL battu ri jaringan tumor yang sama yang direseksi. Situru' siagang siapa are laporang rioloa, sel tumor (CD45-EpCAM +) battu ri ascites siagang tumor nia' tinggina pa'nassaang glukosa na CD8 + siagang CD4 + sel T, na dukungi angkua pa'nassaang glukosa tinggina sel tumor akkullei nipasibandingang siagang sel T. Konsep persaingan sel T. TME. Mingka, aktivitas mitokondria sel tumor labbi tinggi na sel CD8 + T, mingka aktivitas mitokondria sangkammai siagang sel CD4 + T. Anne wassele'na ampakajarreki tema beru ammumba iamintu metabolisme oksidatif parallui untu' sel tumor (41, 42). Nampa pole nakana CD8 + T sel akkullei labbi rentan ri disfungsi oksidatif na CD4 + T sel, iareka CD4 + T sel akkullei a'pake sumber karbon pantaranganna glukosa untu' ampaentengi aktivitas mitokondria (43, 44). Parallui ni issengi angkua anre' na nia' sisalana ri pa'nassaang glukosa iareka pa'gaukang mitokondria ri CD4 + T efektor, T efektor memory siagang T sel memori sentral ri ascites. Kammayatompa, keadaang diferensiasi sel CD8 + T ri tumor tena hubunganna siagang pammopporang ri pa'nassaang glukosa, ampa'nassai sisalana signifikan sel T nikultivasi in vitro siagang TIL rupataua in vivo (22). Anne pa'paressaya ni konfirmasi tongi siagang pa'pakeang alokasi populasi sel otomatis yang tena na bias, yang ampa'nassai pole angkua CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + sel siagang pengambilan glukosa tinggi siagang aktivitas mitokondria na sel tumor sanna' jaina mingka nia' populasi sel aktif metabolik. Populasi anne akkullei a'jari subpopulasi putatif sel penekan myeloid atau sel dendritik plasmasitoid yang diidentifikasi dalam analisis scRNA-seq. Manna mamo anjo ruaya lebba ni laporo ri tumor ovarium rupa tau [45], mingka paralluiji jama-jamang lanjutang iamintu ampakasingaraki anne subpopulasi myeloid.
Manna pole metode berbasis sitometri aliran akkullei na pa'nassai sisalana umum glukosa siagang metabolisme oksidatif ri alla'na jenis sel, metabolit tepat ni pa'jari ri glukosa iareka sumber karbon maraengannaya untuk metabolisme mitokondria ri TME tenapa na nipa'tantu. Appasadia nia yareka tena metabolit ri se'rea TIL subset parallui ni pa'bissa populasi sel battu ri jaringan yang ni gunting. Jari, metode pengayaan selta ni gaukangi siagang spektrometri massa akkullei assarei wawasan ri sesena metabolit yang berbeda-beda pengayaan sel T siagang populasi sel tumor ri sampel pasien yang cocok. Manna pole anne caraya nia keuntunganna ri pa'bageang sel aktif fluoresensi, perpustakaan metabolit tertentu akkullei ni pengaruhi lanri stabilitas bawaan siagang/yareka tingkat pergantian cepat (22). Manna mamo kamma, metodeta akkullei naidentifikasi rua metabolit imunosupresif ni isse', adenosin siagang kynurenine, nasaba' sanna' assisala-salana ri alla'na jenis sampel.
Analisis metabolomik tumor siagang subtipe TIL assarei lohe pa'pahang ri sesena peran metabolit ri TME ovarium. maka se're, ammake flow cytometry, kipa'tantui angkanaya tena sisalana aktivitas mitokondria ri alla'na tumor siagang sel CD4 + T. Mingka, analisis LC-MS/MS napa'butti angkua rie' pa'pinraang signifikan ri pa'bageang metabolit ri tangnga-tangngana anne populasi, ampa'nassai angkua kesimpulang ri sesena metabolisme TIL siagang aktivitas metabolismena secara keseluruhan parallui nipa'bettuang baji'-baji'. Kadua, MNA iami antu metabolit siagang sisalana CD45 siagang sel T ri ascites, teai tumor. Jari, kompartementalisasi siagang lokasi tumor akkullei nia efek maraeng ri metabolisme TIL, yang menyoroti kemungkinan heterogenitas ri lingkungang mikro tertentu. maka tallu, ekspresi enzim penghasil MNA NNMT terutama ni batasi ri CAF, iamintu sel tumor ri tingka' yang kurang, mingka tingka' MNA yang dapat dideteksi diamati di sel T yang berasal dari tumor. Ekspresi berlebih NNMT ri CAF ovarium nia efek promosi kanker yang diketahui, sebagian karena promosi metabolisme CAF, invasi tumor dan metastasis (27). Manna pole tingka TIL secara keseluruhan moderat, ekspresi NNMT ri CAF sanna' sicoco'na siagang subtipe mesenkim Atlas Genom Kanker (TCGA), ia niaka assileo'na siagang prognosis kodi (27, 46, 47). Paccappurenna, ekspresi enzim AOX1 yang bertanggung jawab untuk degradasi MNA juga terbatas pada populasi CAF, yang menunjukkan bahwa sel T kurang kemampuan untuk memetabolisme MNA. Anne wassele'na na dukungi pikkirang angkua manna pole parallui jama-jamang la'bi riolo untu' ampa'nassai anne pa'boyanga, tinggina MNA ri sel T akkullei a'pa'piitteang rie'na lingkungang mikro CAF imunosupresif.
Nasaba tingka ekspresi rannuna transporter MNA siagang tingka protein kunci yang tena nakkulle nideteksi yang terlibat dalam metabolisme MNA, kehadiran MNA ri sel T tena na ni sanna-sannai. NNMT siagang AOX1 tena nakkulle nideteksi siagang analisis scRNA-seq siagang qPCR nitargetkan battu ri rua kohort independen. Anne wassele'na ampa'nassai angkua MNA anre' na ni sintesis ri sel T, mingka ni serap battu ri TME ri tammulilina. Eksperimen in vitro ampa'piitteangi angkua sel T cenderung a'rappungang MNA eksogen.
Studi in vitro ikatte ampa'piitteangi angkua MNA eksogen na induksi ekspresi TNFα ri sel T siagang na pa'nassaang pa'sambungang Sp1 mange ri promotor TNFα. Manna TNFα nia fungsi anti-tumor siagang anti-tumor, ri kanker ovarium, TNFα akkullei na bantui kanker ovarium (31-33). Netralisasi TNFα ri kultur sel tumor ovarium atau eliminasi sinyal TNFα ri model tikus akkullei na pa bajiki produksi sitokin inflamasi yang dimediasi TNFα siagang na halangi pertumbuhang tumor (32, 35). Jari, ri anne passalaka, MNA battu ri TME akkullei a'jari metabolit pro-inflamasi ilalang mekanisme TNFα-dependent ilalang loop autokrin, sa'genna akkullei a'jari siagang a'la'bang kanker ovarium (31). Ri sesena anne kasampatang, blokade TNFα nipelajari salaku agen terapeutik potensial untuk kanker ovarium (37, 48, 49). Nampa pole, MNA na ancuruki sitotoksisitas sel CAR-T mange ri sel tumor ovarium, assarei butti lanjutang untuk penekanan kekebalan yang dimediasi MNA. Sikontu-kontuna, anne wassele'na a'pa'piitteang modele' ri antekamma tumor siagang sel CAF a'sekresi MNA anjari TME ekstraseluler. Battu ri (i) stimulasi pertumbuhan kanker ovarium yang diinduksi TNF dan (ii) penghambatan aktivitas sitotoksik sel T yang diinduksi MNA, ini dapat memiliki efek tumor ganda (Gambar 5D).
Kesimpulanna, siagang ampakei kombinasi pengayaan sel cepat, sekuensing sel tunggal siagang profil metabolisme, anne penelitianga napa'nyatai perbedaan imunometabolomik lompo ri alla'na tumor siagang sel ascites ri pasien HGSC. Analisis komprehensif anne ampa'piitteangi angkua rie' pa'beserang ri pa'nassaang glukosa siagang aktivitas mitokondria ri alla'na sel T, siagang naidentifikasi MNA salaku metabolit pengatur imun otonom non-sel. Anne dataya nia dampakna ri antekamma TME na pengaruhi metabolisme sel T ri kanker rupataua. Manna pole persaingan langsung nutrisi antara sel T siagang sel kanker lebba'mi nilaporo', metabolit akkulle tongi a'jari regulator anre' na langsung untu' ampa'la'bangi perkembangan tumor siagang akkulle tongi antahangi tanggapan imun endogen. Deskripsi lanjutang ri sesena peran fungsionalna metabolit pengatur anne akkullei a'bukka' strategi alternatif untu' ampa'pilajari tanggapang imun anti-tumor.
Spesimen pasien siagang data klinis niallei battu ri repositori jaringan tumor kanker BC ni sertifikasi ri jaringan repositori jaringan kanada. Situru protokol ni setujui ri BC Cancer Research Ethics Committee siagang Universitas British Columbia (H07-00463), sikontu spesimen pasien siagang data klinis ni gappai persetujuan tertulis yang diberitahukan atau secara resmi dilepaskan persetujuan mereka. Sampel nipantama ri BioBank bersertifikat (BRC-00290). Karakteristik pasien rinci ni pa'piitteang ri tabel S1 siagang S5. Untuk kriopreservasi, pisau bedah ni pakei untu' a'urai sampel tumor pasien secara mekanis nampa ni dorong lalang filter 100-mikron untuk anggappa suspensi sel tunggal. Asma pasienna ni sentrifugasi ri 1500 rpm 10 menit ri 4°C untuk pelet sel-sel siagang ampasuluki supernatan. Sel-sel nialle battu ri tumor siagang ascites ni cryopreserve ri 50% serum AB tau ni inaktifkan panas (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) siagang 10% dimetil sulfoksida. Suspensi sel tunggal yang diawetkan ini dicairkan dan digunakan untuk metabolomik dan penentuan metabolit yang dijelaskan di bawah.
Media lengkap terdiri dari 0,22 μm disaring 50:50 ditambahkan RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) nitambai siagang 10% serum AB manusia inaktif panas (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) x1 Penisilin Streptomisin (PenStrep) larutan (Thermo Fisher Scientific) siagang 50 μMB-mercaptoethanol. AimV (Invitrogen) nitambai siagang 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) siagang 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific). Penyangga pewarnaan sitometer aliran terdiri dari 0,22μm saline penyangga fosfat tersaring (PBS; Invitrogen) ditambahkan dengan 3% serum manusia AB inaktif panas (Sigma). Penyangga pengayaan sel terdiri dari 0,22μm PBS yang disaring dan ditambahkan dengan 0,5% serum AB manusia inaktif panas (Sigma-Aldrich).
Ri 37°C media lengkap, sel-sel niwarnai siagang 10 nM MT DR siagang 100 μM 2-NBDG 30 menit. Nampa, sel-sel niwarnai siagang pewarna viabilitas eF506 ri 4°C 15 menit. Suspensi ammotere sel-sel ri FC Block (eBioscience) siagang Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), encerkan ri flow cytometer staining buffer (situru instruksi pabrik), siagang inkubasi 10 menit ri suhu kamar. Nodai sel-sel siagang se're set antibodi (Tabel S2) ri penyangga pewarnaan sitometri aliran ri 4°C 20 menit. Suspensi ammotere sel-sel ri penyangga pewarnaan sitometri aliran (Cytek Aurora; konfigurasi 3L-16V-14B-8R) riolo analisis. Pakei SpectroFlo siagang FlowJo V10 untuk ansalidiki data bilangang sel, siagang pakei GraphPad Prism 8 untuk appaenteng data. Intensitas fluoresensi median (MFI) 2-NBDG siagang MT DR ni log-normalisasi, nampa tes t berpasangan nipake untuk analisis statistik untuk akuntansi pasien yang cocok. Pasulu ngasengi populasi kurang battu ri 40 kajadian battu ri analisis; antama nilai LKM 1 untuk nilai negatif apa-apa mamo riolo anggaukangi analisis statistik siagang visualisasi data.
Untu' ampa'gannaki strategi gating manual ri panel proses ri dallekang, nipakei anotasi penuh ri poko' pambatasang bentu' (FAUST) (21) untu' a'pa'sadia sel secara otomatis mange ri populasi ribokoangna ampa'le'baki sel mate ri FlowJo. Ikatte angngatoro secara manual output untuk ampa'se'rei populasi yang sanna' sala allokasi (ampa'se'rei PD1+ siagang sel tumor PD1) siagang populasi ni pertahankan. massing-massing sampel nia rata-rata labbi 2% sel, untuk 11 populasi.
Sentrifugasi kepadatan gradien ficoll ni pakei untuk ampasisa'laki PBMC battu ri produk pemisahan leukosit (STEMCELL Technologies). CD8 + T sel ni isolasi battu ri PBMC ammake CD8 MicroBeads (Miltenyi) siagang ni pa'la'bangi ri media lengkap ammake TransAct (Miltenyi) 2 minggu situru' instruksi pabrik. Sel-sel ni pa'biangi ammenteng 5 allo ri media lengkap niaka IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), nampa ni rangsang poleang siagang TransAct. Ri allo maka 7, situru instruksi pa'pareka, CD45 MicroBeads (Miltenyi) rupataua nipakei untu' ampa'jari kalumanynyangi sel-sel ri tallu putarang berturut-turut. Sel-sel ni aliquot untuk analisis sitometri aliran (sangkamma ni carita ri dallekang), siagang sejuta sel ni aliquot tallu pissang untuk analisis LC-MS/MS. Sampel ni proses ri LC-MS/MS sangkamma ni carita ri yawa. Ikatte angngukkuruki nilai metabolit yang hilang siagang nomoro ion 1.000. massing-massing sampel ni normalkan siagang nomor ion total (TIC), nipinra logaritmik siagang ni normalisasi otomatis ri MetaboAnalystR riolo analisis.
Suspensi sel tunggal massing-massing pasien ni cairkan siagang ni saring melalui filter 40 μm anjari media lengkap (sangkamma ni carita ri dallekang). Situru protokol pabrik, tallu putarang berturut-turut seleksi positif siagang pemisahan manik magnetik ammake MicroBeads (Miltenyi) nipakei untu' ampa'gannaki sampel untuk sel CD8+, CD4+ siagang CD45- (ri es). Singkatanna, sel-sel ni gantungi ammotere ri penyangga pengayaan sel (sangkamma ni carita ri dallekang) siagang ni bilang. Sel-sel ni inkubasi siagang manik-manik CD8 tau, manik-manik CD4 tau yareka manik-manik CD45 tau (Miltenyi) ri 4°C 15 menit, nampa ni cuci siagang penyangga pengayaan sel. Sampel nipantama ri kolom LS (Miltenyi), siagang fraksi positif siagang negatif ni pa'rappungang. Untu' ampa'kurangi wattu siagang ampa'la'bangi langkah pemulihan sel, CD8-fraksi nampa nipake untu' putarang maka rua CD4+ pengayaan, siagang CD4-fraksi nipake untu' CD45-enrichment ribokoangna. Paentengi larutan ri es lalang sikontu proses pemisahan.
Untu appasadia sampel untuk analisis metabolit, sel-sel ni cuci sikali siagang larutan garam dingin es, siagang 1 ml 80% metanol ni tambai mange ri massing-massing sampel, nampa ni vortex siagang ni bekukan ri nitrogen cair. Sampel nipantama ri tallu siklus beku-cair siagang ni sentrifugasi ri 14.000 rpm 15 menit ri 4°C. Supernatan yang mengandung metabolit diuapkan hingga kering. Metabolit ni larutkan poleang ri 50 μl asam formik 0,03%, ni vortex untu' a'campuru, nampa ni sentrifugasi untu' ampasuluki puing-puing.
Ekstrak metabolit sangkamma ni carita ri dallekang. Paletteki supernatan mange ri botolo kromatografi cair tinggi kinerjana untuk penelitiang metabolomik. Pakei protokol perawatang acak untuk amparakai massing-massing sampel siagang nomoro sel yang sama untuk anjagai efek batch. Ikatte anggaukangi penilaian kualitatif metabolit global yang lebba ni pa'nassai ri AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). Analisis kromatografi siagang integrasi area puncak nigaukangi ammake perangkat lunak MultiQuant versi 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Ion bilangang 1000 nipakei untu' angngukkuruki nilai metabolit yang hilang, siagang TIC massing-massing sampel nipakei untu' anghitung area puncak normalisasi massing-massing metabolit nideteksi untu' ampakabajiki pa'pinraang nipantama' ri analisis instrumental battu ri pa'prosesang sampel. Punna TIC ni normalisasi, MetaboAnalystR(51) (parameter default) ni pakei untuk konversi logaritmik siagang penskalaan garis norma otomatis. Ikatte ampakei PCA siagang paket vegan R untuk anggaukangi analisis eksplorasi perbedaan metabolom antara jenis sampel, siagang ampakei analisis redundansi parsial untuk analisis pasien. Pakei metode Ward untuk ambangung dendrogram peta panas untuk ampa'rappungi jarak Euclidean ri alla'na sampel. Ikatte ampakei limma (52) ri kelimpahan metabolit standar untuk angngassengi metabolit kelimpahan secara berbeda ri sikontu jenis sel siagang lingkungang mikro. Untu' ampa'sadiai pa'pau, kipakei parameter rata-rata kelompo' untu' ampattantui modele'na, siagang niparhatikangi rupanna sel ri lingkungang mikro salaku massing-massing kelompo' (n = 6 kelompo'); untuk tes signifikansi, nigaukangi tallu pengukuran berulang untuk massing-massing metabolit Untu angngewai replikasi sala, pasienna nipantamaki salaku halangan ri desain limma. Untu' ansalidiki sisalana metabolit ri tangnga-tangngana pasienna, kipa'se'rei modele limma antama' pasienna lalang cara tette'. Ikatte allaporoki signifikansi kontras pra-tentukan antara jenis sel siagang lingkungan mikro Padj <0,05 (koreksi Benjamini-Hochberg).
Punna lebaki ni pa'gajiang siagang Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% viabilitas), sekuensing transkriptom sel tunggal nigaukangi ri total sampel asma beku siagang tumor ammake protokol ekspresi gen 10x 5′. Lima kasus siagang tumor siagang ascites yang cocok ni analisis, manna pole viabilitas rendah battu ri se're sampel tumor anre' na'kulle antama'. Untu' ampa'gannaki pa'pileang pasieng, nipa'se'rei sampelna massing-massing pasienna ri jalur 10x kontroler kromium, siagang nianalisis ascites siagang situs tumor sisa'la'-sa'la'. Punna lebaki ni urutan [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), genom Quebec; rata-rata 73.488 siagang 41.378 bacaang per sel untuk tumor siagang ascites masing-masing]], ikatte ampakei CellSNP siagang Vireo (53) (berdasarkan CellSNP sebagai SNP manusia umum (VCF) yang disediakan oleh GRCh38 ditugaskan identitas donor. Ikatte menggunakan SNPRelate untuk menyimpulkan identitas terdekat (IBS) status genotipe pasien (IBS) tena na antama sel-sel yang tena ni tugaskan siagang sel-sel yang ni identifikasi sebagai dupleks siagang donor yang cocok antara sampel ascites siagang tumor (54). (2792 siagang 4183 sel battu ri tumor siagang ascites, massing-massing) untuk analisis. Ikatte ampakei igraph's (57) Louvain clustering of shared nearest neighbor network (SNN) berdasarkan Jaccard distance to cluster cells by ekspresi. sel-sel ni definisikan ri ekspresi CD8A siagang GZMA, anre' na antama' subkluster siagang ekspresi protein ribosom rannu. Ikatte antama' ri data nu'pa'nassaya Izar et al.
PBMC nipisangkai battu ri produk pemisahan leukosit (STEMCELL Technologies) siagang sentrifugasi kepadatan gradien Ficoll. CD3 + sel ni isolasi battu ri PBMC ammake manik CD3 (Miltenyi). Ri wattu nia yareka tena MNA, sel CD3+ ni aktifkan siagang CD3 (5μg/ml), CD28 larut (3μg/ml) siagang IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Ri allo kalabbusang ekspansi, viabilitas (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) siagang proliferasi (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) ni evaluasi siagang flow cytometry. Evaluasi fungsi efektor siagang stimulasi sel siagang PMA (20 ng/ml) siagang ionomycin (1μg/ml) siagang GolgiStop 4 jam, siagang pantau CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4) , BioLegend) siagang TNFα-fluoresce insothianate (TCb1) BD). Rangsang qPCR siagang sel ChIP siagang PMA (20 ng/ml) siagang ionomycin (1μg/ml) 4 jam. Supernatan ELISA ni pa'rappungang riolo siagang ribokoangna stimulasi siagang PMA (20 ng/ml) siagang ionomisin (1 μg/ml) 4 jam.
Turuki protokol pa'pareka untu' angngisolasi RNA ammake RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Pakei QIAshredder (QIAGEN) untuk a'homogenisasi sampel. Pakei RNA tinggi-kapasitas mange ri cDNA kit (Thermo Fisher Scientific) untuk ansintesis DNA komplementer (cDNA). Pakei TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) untu' angngukkuruki ekspresi gen (situru' protokol pa'pare'na) siagang probe kamma anne: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs0042755515S, 2012 Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-phosphate off Hydrogen (GAPDH)] siagang Hs01010726_m1 (SLC22A2). Sampel ni jalankan ri sistem PCR real-time StepOnePlus (Biosistem Terapan) (Biosistem Terapan) ri pelat reaksi 96-sumur optik cepat MicroAmp (Biosistem Terapan) siagang film optik MicroAmp. Sikontu nilai Ct yang labbi 35 ni anggappai irate ri ambang batas deteksi siagang ni tanrai tena nakkulle nideteksi.
Gaukangi ChIP sangkamma lebaka nipau riolo (58). Singkatna, sel-sel nirawat siagang formaldehida (konsentrasi akhir 1,42%) siagang ni inkubasi ri suhu kamar 10 menit. Pakei penyangga bengkak tambahan (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl siagang 0,1% NP-40) ri es selama 10 menit, nampa ni suspend pole ri penyangga imunopresipitasi sangkamma ni carita (58). Sampel nampa ni sonikasi siagang siklus kamma anne: 10 siklus (20 pulsa 1-detik) siagang wattu statis 40 detik. Inkubasi ChIP-grade immunoglobulin G (Teknologi Pensinyalan Sel; 1μl), histon H3 (Teknologi Pensinyalan Sel; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) siagang SP1 (Teknologi Pensinyalan Sel; 3μl) antibodi siagang sampel ri 4°CC goyang bangngi. Inkubasi manik-manik protein A (Thermo Fisher Scientific) siagang sampel ri 4°C siagang goyang-goyang sanna' sallona 1 jam, nampa pakei manik-manik chelex (Bio-Rad) untu' ampa'jari kalumanynyang DNA, siagang pakei proteinase K (Thermo Fisher) untu' pencernaan protein. Promotor TNFα nideteksi ri PCR: mange ri dallekang, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; mingka, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp produk). Gambara ni paenteng ri Image Lab (Bio-Rad) siagang ni ukkuru ammake perangkat lunak ImageJ.
Supernatan kultur sel ni pa'rappungang sangkamma ni carita ri dallekang. Pa'tantuangna nigaukangi situru' prosedur pa'paentengang kit ELISA TNFα tau (Invitrogen), kit ELISA IL-2 tau (Invitrogen) siagang kit ELISA IFN-γ tau (Abcam). Situru protokol pabrik, supernatan ni encerkan 1:100 untuk angngassengi TNFα siagang IL-2, siagang 1:3 untuk angngassengi IFN-γ. Pakei EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) untuk angngukuri absorbansi ri 450 nm.
PBMC nipisangkai battu ri produk pemisahan leukosit (STEMCELL Technologies) siagang sentrifugasi kepadatan gradien Ficoll. CD3 + sel ni isolasi battu ri PBMC ammake manik CD3 (Miltenyi). Ri wattu nia yareka tena MNA, sel CD3+ ni aktifkan siagang CD3 (5μg/ml), CD28 larut (3μg/ml) siagang IL-2 (300 U/ml; Proleukin) 3 allo. Punna lebaki 3 allo, sel-sel ni pa'rappungang siagang ni cuci siagang 0,9% saline, nampa pelet ni bekukan. Pa'bilangang sel nigaukangi siagang flow cytometry (Cytek Aurora; konfigurasi 3L-16V-14B-8R) ammake 123count eBeads.
Ekstrak metabolit sangkamma ni carita ri dallekang. Ekstrak kering ni rekonstitusi ri konsentrasi 4000 sel setara/μl. Analisis sampel siagang kromatografi fase terbalik (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) siagang kolom CORTECS T3 (2,1×150 mm, ukurang partikel 1,6-μm, ukurang pori 120-Å; #186008500, Waters). Spektrometer massa kutub (6470, Agilent), ri antere ionisasi elektrospray anjama ri mode positif. Fase mobile A iami antu 0,1% asam formik (ri H2O), fase mobile B iami antu 90% asetonitril, 0,1% asam formik. Gradien LC iamintu 0 sanggenna 2 menit untuk 100% A, 2 sanggenna 7,1 menit untuk 99% B, siagang 7,1 sanggenna 8 menit untuk 99% B. Nampa ni seimbangkan pole kolom siagang fase mobile A ri laju aliran 0,6 ml/min untuk 3 menit. . Laju aliranna 0.4ml/min, siagang kamara kolom ni panaiki sa'genna 50°C. Pakei standar kimia murni MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) untuk ampaentengi wattu retensi (RT) siagang transformasi (RT = 0,882 menit, transformasi 1 = 137→94,1, transformasi 2 = 137→92 , Konversi = 13→787). Punna anjo tallua transisi kajariang ri wattu retensi yang annaba, transisi 1 ni pakei untuk kuantifikasi untuk ampassakkei spesifisitas. Kurva standar MNA (Toronto Research Chemical Company) ni pa'jari battu ri annang pengenceran serial larutan stok (1 mg/ml) untuk anggappa standar 0,1, 1,0, 10 siagang 100 ng/ml siagang 1,0 siagang 10 μg/ml massing-massing cair. Batas deteksi iamintu 1 ng/ml, siagang tanggapang linier iamintu 10 ng/ml siagang 10μg/ml. massing-massing injeksi rua mikroliter sampel siagang standar ni pakei untuk analisis LC/MS, siagang sampel kontrol kualitas campurang ni jalankan massing-massing salapang injeksi untuk ampa'tantui stabilitas platform analisis. Tanggapan MNA battu ri sikontu sampel sel nirawat MNA niaki lalang rentang linier assay. Analisis data nigaukangi ammake perangkat lunak analisis kuantitatif MassHunter (v9.0, Agilent).
Generasi kedua αFR-CAR konstruksi niallei battu ri Song et al. (59). Singkatna, anjo konstruksia nia kontenna: urutan pemimpin CD8a, fragmen variabel rantai tunggal spesifik αFR manusia, engsel CD8a siagang wilayah transmembran, domain intraseluler CD27 siagang domain intraseluler CD3z. Urutan CAR lengkap ni sintesis ri GenScript, nampa ni kloning anjari vektor ekspresi lentivirus generasi kedua ri ulu kaset ekspresi GFP ni pake untu' ansalidiki efisiensi transduksi.
Lentivirus ni paentengi battu ri transfeksi sel HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); nipa'bakka' ri Dulbecco's modified Eagle medium niaka 10% fetal bovine serum (FBS) siagang 1% PenStrep, siagang nipake vektor CAR-GFP siagang plasmid kemasan (psPAX2 siagang pMD2.G, Addgene) nipake lipofection amine (Sigma-Aldrich). Supernatan yang mengandung virus dikumpulkan 48 dan 72 jam setelah transfeksi, disaring, dan dikonsentrasikan dengan ultrasentrifugasi. Simpan supernatan virus pekat ri -80°C sanggenna transduksi.
PBMC nipisangkai battu ri produk pemisahan leukosit donor sehat (STEMCELL Technologies) siagang sentrifugasi kepadatan gradien Ficoll. Pakei CD8 microbeads seleksi positif (Miltenyi) untuk angngisolasi sel CD8+ battu ri PBMC. Rangsang sel T siagang TransAct (Miltenyi) siagang ri media TexMACS [Miltenyi; nitambai siagang 3% serum tau tenaya na aktif, 1% PenStrep siagang IL-2 (300 U/ml)]. ruampulo appa jam ribokoangna stimulasi, sel T ni transduksi siagang lentivirus (10 μl supernatan virus pekat per 106 sel). 1 sanggenna 3 allo ribokoangna transduksi ri Cytek Aurora (ri FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), evaluasi ekspresi GFP sel untuk ampa'piitteang efisiensi transduksi kaminang kurang 30%.
Sel CAR-T nikultivasi 24 jam ri Immunocult (STEMCELL Technologies; nitambai 1% PenStrep) ilalang kondisi kamma anne: tena nirawat, nirawat siagang 250 μM adenosin atau 10 mM MNA. Punna lebaki praperawatan, sel CAR-T ni cuci siagang PBS nampa ni passe're siagang 20.000 sel SK-OV-3 [ATCC; ri McCoy 5A medium (Sigma-Aldrich) nitambai siagang 10% FBS siagang 1% PenStrep ri 10: Rasio efektor mange ri target 1 ni perkuat ri tallu kali ri media Immunocult nitambai. Sel SK-OV-3 siagang sel SK-OV-3 ni lisis siagang digitalis saponin (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) nipakei salaku kontrol negatif siagang positif, massing-massing. Punna lebaki 24 jam co-kultivasi, supernatan ni pa'rappungang siagang laktat dehidrogenase (LDH) ni ukkuru situru' instruksi pabrik (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Supernatan LDH ni encerkan 1:50 ri penyangga LDH. Persentase pammunoang ni ukkuru siagang rumus kamma anne: persentase pammunoang = persentase koreksi / tingkat pammunoang maksimal x 100%, na persentase koreksi = ko-kultur-sel T bawang, siagang tingkat pammunoang maksimal = kontrol positif-kontrol negatif.
Sangkamma ni carita ri teks iareka bahan siagang cara, pakei GraphPad Prism 8, Microsoft Excel iareka R v3.6.0 untuk analisis statistik. Punna lohe sampel nialle battu ri pasien yang sama (sangkamma ascites siagang tumor), kipakei uji t berpasangan atau antama pasien salaku efek acak ri modele linier atau umum punna cocok. Untuk analisis metabolomik, tes kepentingan dilakukan dalam tiga kali.
Untuk bahan tambahan untuk artikel ini, silahkan lihat http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
anne iami antu artikel akses terbuka ni distribusikan ri sesena paratorang Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, yang memungkinkan penggunaan, distribusi dan reproduksi dalam media apa pun, asalkan penggunaan terakhir tidak untuk keuntungan komersial dan premisnya adalah bahwa karya aslinya benar. Referensi.
Catatang: Ikatte appalakki bawang ri kau sollanna nupassareang alamat emailnu sollanna tau nu rekomendasikan mange ri halamanga naisse'i angkanaya ero'nu nacini' emailnu siagang teai spam. Ikatte tena na la angngalle alamat email.
anne pakkuta'nang ni pakei untu' anuji punna ikatte tau battu siagang anjagai pa'sareang spam otomatis.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. Dephrini (R.R.R. Bellnis), Dephardnis. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA a'bantui ri penekanan kekebalan sel T siagang a'jari target imunoterapi potensial untuk pa'balle kanker rupa tau.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. Dephrini (R.R.R. Bellnis), Dephardnis. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA a'bantui ri penekanan kekebalan sel T siagang a'jari target imunoterapi potensial untuk pa'balle kanker rupa tau.
©2021 Asosiasi Amerika untuk Kemajuan Sains. sikontu ha'na nijaga. AAAS iami antu pa'samaturukang HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef siagang COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.