Pa'bageang protein ri jalur sekresi parallui untu' ampaentengi kompartementalisasi sel siagang homeostasis. Ri tambanganna pa'bageang ni mediasi cangkang, peran lipid ri pa'bageang kinesin ri laleng proses transportasi sekresi iami antu pakkuta'nang dasar yang sallo-salloa yang tenapa ni jawab. Anrinni, kigaukangi pencitraan real-time resolusi tinggi multiwarna simultan 3D untu' ampa'butti in vivo angkua protein baru ni sintesis glikosilfosfatidilinositol-imobilisasi siagang bageang lipid seramida sanna' la'buna ni kelompokkan siagang ni golongkan anjari situs keluar bersih endoplasma khusus, yang berbeda dari protein transmembran yang digunakan. Nampa pole, kipa'piitteang angkua la'buna rante ceramide ri membran retikulum endoplasma parallui untu' selektifitas pa'bageang. Anne pa'pilajarangta assarei butti in vivo langsung maka se're untu' ampa'bageangi kargo protein situru' la'buna rantai lipid anjari tampa' ekspor selektif ri jalur sekresi.
Ri sel eukariotik, protein ni sintesis ri retikulum endoplasma (ER) nampa ni urusi ri wattu transportasi melalui jalur sekresi untuk nipantama mange ri tujuan seluler yang sesuai (1). Ri tambanganna pa'pilajarang ni mediasi lapisi, sanna'mi sallona ni pikkiri' angkanaya lipid-lipid mattantua akkulle tongi a'jari titik assulu' selektif lanri napa'rappungi ke'nanga anjari domain membran tertentu na protein tertentu (2-5). Mingka, rie' ija kurangna butti langsung in vivo untu' ampa'butti mekanisme berbasis lipid. Untu' ampa'le'baki anne masala poko'a, niparessai ri ragi antekamma batena glikosilfosfatidilinositol (GPI) protein berlabuh (GPI-APs) ni ekspor secara berbeda battu ri ER. GPI-APs iami antu sangkamma protein permukaan sel terhubung lipid ( 6, 7). GPI-AP iami antu protein yang ni sekresi ni pasangi ri lembaran luar membran plasma melalui bagian glikolipid (jangkar GPI). Natarimai jangkar GPI salaku modifikasi pasca-translasi konservatif ri lumen ER (8). Punna lebaki nipasang, GPI-AP allaloi ri aparat Golgi (5, 9) battu ri ER mange ri membran plasma. Kehadiran jangkar GPI na pa'jari GPI-AP ni anging sisa'la' battu ri protein sekresi transmembran (pantama' tongi protein membran plasma maraengannaya) ri se'reang jalur sekresi (5, 9, 10). Ri sel ragi, GPI-APs nipisangkai battu ri protein sekresi maraengannaya ri retikulum endoplasma, nampa ni bungkus anjari vesikel unik ni bungkus ri kompleks protein lapisan II (COPII) (6, 7). Determinan proses klasifikasi anne ri proses ekspor ER tena natangkasa, mingka ni anggap angkua anne mekanisme akkullei naparalluangi lipid, terutama remodeling struktural bageang lipid jangkar GPI (5, 8). Ri ragi, remodeling lipid GPI appakkaramulami langsung ribokoangna GPI a'lette, siagang ri lohe kasus, iami antu ampa'jari ceramide a'reppese' mange ri asam lemak jenuh rantai panjang 26-karbon (C26:0) (11, 12). C26 ceramide iami antu ceramide utama ni pa'jari ri sel ragi sa'genna kamma-kamma anne. Iamintu ni sintesis ri ER siagang sanna' jaina ni ekspor mange ri aparat Golgi ilalang vesikel COPII (13). Ekspor ER GPI-AP khususna parallui sintesis seramida yang tulusu (14, 15), siagang ri giliranna, konversi seramida mange ri inositol fosfat seramida (IPC) ri aparat Golgi tagantungi ri sintesis jangkar GPI (16). Studi biofisika siagang membran buatan ampa'piitteangi angkua ceramida rantai asil sanna' la'buna akkullei a'se're untu' a'bentu' domain teratur siagang sipa' fisik unik (17, 18). Anne dataya angngerangi hipotesis angkua C26 ceramide siagang GPI-AP siagang C26 ceramide a'pakei sipa' fisikna untu' a'samaturu' anjari daera teratur iareka daera ri lingkungang lipid membran ER yang relatif kacau. Anne poko'na nibangung battu ri gliserolipid sike'de' siagang tena na jenuh (C16:1 siagang C18:1) (19, 20). Anne daera-daeraya lani fokuskan secara selektif ri situs assulu ER (ERES) tertentu, na kere-keremae ceramide siagang GPI-AP berbasis ceramide akkullei ni co-transport mange ri Golgi ri vesikel COPII khusus yang sama (5).
Ri anne pa'pilajaranga, ikatte le'ba'mi langsung anuji mekanisme berbasis lipid anne siagang ammake mikroskop pencitraan real-time konfokal super-resolusi (SCLIM), iamintu teknik mikroskop canggih yang akkulle secara bersamaan anciniki protein berlabel fluoresen Gambar tiga warna dan tiga dimensi (3D) memiliki resolusi yang sangat tinggi dan cepat dalam sel hidup (22, 22).
Ikatte uru-uruna ampakei teknologi SCLIM untu' ampa'nassai antekamma batena GPI-AP normal siagang kelompok ceramida C26 ni saring battu ri protein ni sekresi transmembran ribokoangna assulu' battu ri ER ri S. cerevisiae. Untu' amparessai pa'bageang ER, kipakei sistem genetik nu'kullea langsung a'visualisasi kargo beru ni sintesis antama' ri ERES in vivo (7, 23). Salaku kargo, ammilei C26 ceramide-based GPI-AP Gas1 ni label siagang protein fluoresen hijau (GFP) siagang protein sekresi transmembran Mid2 ni label siagang protein fluoresen inframerah dekat (iRFP), rua-ruanna ni targetkan membran plasma (24-26). Ri sec31-1 mutan sensitif suhu, anne ruaya kargo ni ekspresikan ri rawanganna promotor induksi galaktosa siagang penanda ERES konstitutif. Ri suhu ekstrim (37°C), nasaba mutasi sec31-1 na pengaruhi fungsi komponen lapisan COPII Sec31 untu' antahangi perkecambahan COPII siagang ekspor ER, kargo baru ni sintesis a'rappungang ri ER (23). Punna lebaki ni dinging mange ri suhu rannu (24°C), sel mutan sec31-1 ammotere battu ri area sekresi, siagang kargo sintetis beru ni pa'rappungang appakkaramulami ni ekspor battu ri ER. Visualisasi CLIM ampa'piitteangi angkua sanna' jaina Gas1-GFP siagang Mid2-iRFP beru ni sintesis tuli a'rappungang ri ER sel mutan sec31-1 ribokoangna inkubasi ri 37°C nampa nipasulu ri 24°C 5 menit (Gambara 1). Nasaba Mid2-iRFP ni distribusikan ri sikontuna membran ER, siagang Gas1-GFP ni konsentrasi siagang ni pa'rappungang ri area membran ER yang tena na tulusu, distribusina sanna' assisala-salana (Gambara 1, A mange ri C siagang Film S1). Nampa pole, sangkamma ni cini'a ri gambara 1D, kluster Gas1-GFP tena Mid2-iRFP. Anne wassele'na ampa'nassai angkua GPI-AP siagang protein transmembran nipisangkai anjari daera membran ER beru. Gugus Gas1-GFP niaki ri ampi'na ERES spesifik ni label siagang protein lapisan COPII mCherry Sec13 (Gambara 1, E siagang F, siagang film S1) (23).
sel sec31-1 mengekspresikan sekresi yang diinduksi galaktosa, rantai asil panjang (C26) keramida GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, hijau) dan protein transmembran Mid2-iRFP (TMP, biru) dan anne pelabelan ERES Konstruktif Sec13-mCherry (E) ni inkukusi untuk RES13-3, 37 menit, nipalette mange ri 24°C, siagang ni gambara ri SCLIM 5 menit ribokoangna. (A mange ri C) ampa'piitteang gambara 2D ni pa'se're iareka gambara tunggala battu ri se'reang bidang (A), gambara proyeksi 2D battu ri 10 z-section (B) iareka gambara belahan sel 3D battu ri kargo siagang penanda ERES (C). Skala bar 1μm (A siagang B). Satuan skala iamintu 0.551μm (C). Gas1-GFP nideteksi ri daerah ER diskrit atau kluster, sementara Mid2-iRFP nideteksi siagang ni distribusikan ri sikontu membran ER (C). (D) Grafik ampa'piitteangi intensitas fluoresensi relatif Gas1-GFP siagang Mid2-iRFP ri kluster Gas1-GFP ri garisi panah pute (kiri). AU, unit sewenang-wenang. (E siagang F) a'wakil gambara 3D nu a'pa'se're barang siagang tanra ERES. Gugus Gas1-GFP nideteksi ri ampi'na ERES spesifik. Satuan skala iamintu 0.551μm. (F) Panah padat pute anjari tanra Gas1-GFP cluster ni pasisambungang siagang ERES. Panel tangnga siagang kanang ampa'piitteang gambara 3D ni pa'se're siagang pa'piitteang nipinra battu ri kluster Gas1-GFP nipile.
Hubungan spasial yang dekat antara kluster Gas1-GFP dan ERES spesifik menunjukkan bahwa Gas1-GFP dapat memasuki ERES selektif, yang berbeda dari selektifitas yang digunakan oleh Mid2-iRFP untuk keluar dari ER. Untu' ampa'le'baki anne kasampatanga, ni ukkuru'mi rasio ERES untu' se'reji bawang yareka rua barang (Gambara 2, A sa'genna C). Ikatte anggappai angkua lohe ERES (70%) nia se'reji bawang rupanna kargo. Gambara ri rawanganna gambara 2C ampa'piitteang rua conto khas ERES siagang Gas1-GFP bawang (Gambara 1) iareka Mid2-iRFP bawang (Gambara 2). Sikontutojenna, kira-kira 20% ERES nia rua kargo nu tumpang tindih ri se'rea tampa. Ni gappai angkua rie' ERES (10%) nia rua rupanna kargo, mingka ni isolasi ri tampa' maraeng. Jari, anne analisis statistik ampa'piitteangi angkua ribokoangna ER ni ekspor, GPI-AP Gas1-GFP siagang kargo transmembran Mid2-iRFP ni bage anjari ERES maraeng (Gambara 2D). Efisiensi penyortiran anne sanna' konsistenna siagang analisis biokimia riolo (6) siagang penentuan morfologis (7). Ikatte akkulle tongi anciniki panggaukanna kargo ni karantina antama ri ERES (Gambara 2E siagang Film S2). Gambar 2E ampa'piitteangi angkua sike'de'ji bawang Gas1-GFP (panel 3) iareka Mid2-iRFP (panel 4) antama' ri ERES battu ri se'reang sa'ri siagang nipantama' ri tampa' tassa'la'. Panel 5 ri gambara 2E ampa'piitteangi angkua Gas1-GFP siagang Mid2-iRFP biasana ni gappai ri ERES yang sama, mingka antama' battu ri sisi maraeng siagang ni konsentrasikan ri tampa' maraeng yang akkulle a'wakil vesikel COPII maraeng. Ikatte to'ji ampa'nassai angkua pa'bageang siagang pa'bageang C26 ceramide-based GPI-AP Gas1 salaku ERES selektif iami antu spesifik nasaba' kargo sekresi transmembran maraeng, protein membran plasma GFP-tagged Axl2 (27 ), ampa'piitteangi panggaukang sangkamma Mid2-iRFP. (Gambara S1 siagang Film S3). Axl2-GFP beru ni sintesis ni distribusikan melalui membran ER sangkamma Mid2-iRFP (Gambara S1, A siagang B), siagang ni co-lokalisasi siagang Mid2-iRFP ri se'reang ERES (Gambara S1, B sanggenna D). Panel 1 siagang 2 ri gambara 1. S1C ampa'piitteang rua conto khas ERES na rua kargo transmembran tumpang tindih. Ri anne kasus, ruaya barang antama ri ERES sipa'rua (Gambara S1E, Panel 3 siagang Film S3).
Sel sec31-1 yang mengekspresikan sekresi induksi galaktosa, Gas1-GFP (GPI-AP, hijau) dan Mid2-iRFP (TMP, biru) dan pelabelan ERES konstitutif Sec13-mCherry (ERES, magenta) diletakkan pada 37 Selesai diinkubasi selama 30 menit pada °C, dilepaskan ke ion, dan diblokir ke sekresi siagang SCLIM ribokoangna 20 menit. (A mange ri C) gambara proyeksi 2D representatif (A; skala bar, 1μm) atau gambara belahan sel 3D (B siagang C; unit skala, 0,456μm) battu ri kargo siagang 10 z-section ni tanrai siagang ERES. Panel rawaya ri (B) siagang panel ri (C) ampa'piitteang gambara ni proses untu' ampa'piitteang bawang barang-barang niaka ri ERES (magenta) [Gas1-GFP (abu-abu) siagang Mid2-iRFP (biru ca'di)]. (C) Panah terbuka: ERES bawang angngerang se're kargo (1 sanggenna 4). Panah abu-abu: ERES nia kargo nipisangkai (5). Panah padat kebo: ERES niaka kargo niaka ri tampa'na. Ri bawa: ERES tunggal nipile nia bawang Gas1-GFP (1) atau Mid2-iRFP (2). Bar skala, 100 nm. (D) Kuantifikasi fotomikrograf ni carita ri (C). Persentase rata-rata ERES yang nia se'reji kargo (Gas1-GFP atau Mid2-iRFP), kargo terpisah siagang kargo tumpang tindih. Ri tallu paccoba independen, n=432 ri 54 sel. Error bar = SD. Uji t dua ekor yang tidak berpasangan. *** P = 0.0002. (E) gambara 3D ERES nipile battu ri kargo ni karantina ni tanrai siagang (C). Gas1-GFP (hijau) (3) atau Mid2-iRFP (biru) (4) antama ri ERES (magenta) battu ri se'reang sa'ri siagang ni batasi mange ri tampa' ca'di lalang ERES. Sikali-kali, ruaya rupanna kargo antama ri ERES (5) battu ri se'reang sa'ri siagang nipantama ri tampa' ta'lappasa' lalang ri ERES. Bar skala, 100 nm.
Nampa, niuji hipotesis angkua ceramida rantai asil lantang (C26) niaka ri membran ER angngerangi clustering siagang penyortiran spesifik Gas1 anjari ERES selektif. Untuk anne, kipakei strain ragi yang dimodifikasi GhLag1, di mana dua sintase keramida endogen Lag1 dan Lac1 diganti oleh GhLag1 (homolog Lag1 dari kapas), yang menghasilkan strain ragi dengan strain Ceramide membran sel yang lebih pendek dari tipe liar (Gambar 3A) (28). Analisis spektrometri massa (MS) ampa'piitteangi angkua ri strain tipe liar, 95% battu ri total keramida sanna' la'buna (C26) ceramida rantai, sementara ri GhLag1, 85% keramida sanna' la'buna (C18 siagang C16). ), 2% bawang ceramide sanna lantangna (C26) rantai ceramide. Manna pole C18 siagang C16 seramida iami antu seramida utama nideteksi ri membran GhLag1 sa'genna kamma-kamma anne, analisis MS napa'butti tongi angkanaya jangkar GPI Gas1-GFP niekspresikan ri strain GhLag1 nia' C26 seramida, ia niaka sangkamma lipid tipe liar. Kualitasna sangkamma (Gbr. 3A) (26). Jari, anne battuanna enzim remodeling seramida Cwh43 sanna'i selektifna untu' seramida C26, sangkamma ni cini'a ri gambara 26, iami antu preferensial antama'i jangkar GPI battu ri sike'de' ceramida C26 ri strain GhLag1. S2 (29). Manna mamo kamma, membran sel GhLag1 pada dasarna nia bawang C18-C16 ceramide, sementara Gas1-GFP nia ija C26 ceramide. Anne faktaya ampa'jari anne strain a'jari alat ideal untu' secara khusus ampa'le'baki masalah lantangna rantai asil membran ceramide ri ER. Peran hipotetis kelas siagang penyortiran. Nampa, uru-uruna nipelajari pakkullena C26 Gas1-GFP untu' a'rappungang ri kluster ri GhLag1 siagang alel mutan sensitif suhu sec31-1 ilalang mikroskop fluoresensi konvensional, na anjo rantai lantang (C18-C16) bawang nia' ri membran ER Ceramide (Gbr. 3). Ikatte anciniki angkua ri sec31-1, sanna' jaina Gas1-GFP ni konsentrasikan ri sec31-1 GhLag1 siagang lantang (C18-C16) lantang ceramide ER membran terutama tena ni cluster siagang ni distribusikan ri ri sikontuna membran ER. Untu' a'jari tojeng, nasaba' C26 ceramide-based clustering sanna' sicoco'na siagang ERES spesifik (Gambara 1), ribokoangna niparessai maka anne prosesa akkulle tongi antama' fungsi mekanisme protein ekspor ER. GPI-AP ammake sistem COPII khusus untuk ekspor ER, yang aktif diatur oleh remodeling struktural Ted1′s bagian glikan jangkar GPI (30, 31). GPI-glikan rekombinan nampa ni isse'i ri reseptor kargo transmembran kompleks p24, yang pada gilirannya secara selektif merekrut Lst1, yang merupakan isoform spesifik dari subunit pengikatan kargo COPII utama Sec24, membentuk GPI-AP-kaya COPII Vesikel yang diperlukan (31-33). Jari, ikatte ambangung mutan ganda yang menggabungkan penghapusan protein tunggal ini (komponen kompleks p24 Emp24, enzim remodeling GPI-glikan Ted1 dan subunit COPII spesifik Lst1) siagang galur mutan sec31-1, siagang amparessai ke'nanga Maka akkullei a'bentu' Gas1-Luster GFP (Gambara 3). Ikatte anciniki angkua ri sec31-1emp24Δ siagang sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP terutama tena na ni kelompokkan siagang ni distribusikan ri sikontu membran ER, sangkamma riolo ni cini ri sec31-1 GhLag1, sementara ri sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP Sangkamma sec31-1-1. Anne wassele'na ampa'nassai angkanaya pantaranganna nia'na C26 ceramide ri membran ER, clustering Gas1-GFP parallu tongi a'samaturu' ri kompleks p24, siagang tena naparallu rekrutmen Lst1 khusus. Nampa, kiparessai kasampatang angkua lantangna rante ceramide ri membran ER akkullei angngatoro pa'sambungang Gas1-GFP mange ri p24. Mingka, nia'mo nigappa C18-C16 ceramide ri membran tena na'kulle a'jari GPI-glikan ni rekonstruksi ri kompleks p24 (Gambara S3 siagang S4, A siagang B) iareka a'reppese' mange ri GPI-AP siagang a'ekspor GPI-AP. pakkul leyang. Rekrut COPII subtipe Lst1 (Gambara S4C). Jari, C26 ceramide-dependent clustering tena naparallu interaksi protein siagang mekanisme protein ekspor ER yang berbeda, mingka na dukungi mekanisme penyortiran alternatif ni dorong ri lantangna lipid. Nampa, ikatte ansalidiki maka lantangna rantai asil ceramida ri membran ER parallui untuk klasifikasi efektif Gas1-GFP salaku ERES selektif. Nasaba Gas1 ri strain GhLag1 siagang ceramida rantai sike'de' assulu' battu ri ER siagang antama' ri membran plasma (Gambara S5), ikatte tappaki punna pa'bageang ni dorong ri la'buna rantai asil ceramida, Gas1 ri strain GhLag1 akkullei nipinra siagang ni silang. barang ERES siagang membran yang sama.
(A) Membran sel GhLag1 terutama mengandung ceramida C18-C16 yang lebih pendek, sementara jangkar GPI Gas1-GFP masih memiliki C26 IPC yang sama dengan sel tipe liar. Ri dallekang: analisis panjang rantai asil ceramide ri membran sel tipe liar (Wt) siagang strain GhLag1p siagang spektrometri massa (MS). Dataya a'wakilkangi persentase battu ri total ceramide. Rata-rata battu ri tallu paccoba independen. Error bar = SD. Uji t dua ekor yang tidak berpasangan. **** P ＜0.0001. Panel rawanganna: analisis MS ri lantangna rantai asil IPC niaka ri Gas1-GFP (GPI-IPC) jangkar GPI ni ekspresikan ri strain tipe liar siagang GhLag1p. Dataya a'wakilkangi persentase battu ri sinyal IPC. Rata-rata lima paccoba independen. Error bar = SD. Uji t dua ekor yang tidak berpasangan. ns, tena naparallu. P = 0.9134. (B) Mikrograf fluoresensi sel sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ siagang sec31-1lst1Δ sel yang mengekspresikan Gas1-GFP yang diinduksi galaktosa diinkubasi pada 37°C selama 30 menit dan dilakukan rutin fluoresensi mikroskop ribokoangna 24°C. Panah pute: ER Gas1-GFP cluster. Panah terbuka: Gas1-GFP yang tidak terkelompok tersebar di seluruh membran ER, menunjukkan pewarnaan cincin nuklir karakteristik ER. Bar skala, 5μm. (C) Kuantifikasi fotomikrograf ni carita ri (B). Rata-rata persentase sel siagang struktur Gas1-GFP bertitik. Ri tallu paccoba independen, n≥300 sel. Error bar = SD. Uji t dua ekor yang tidak berpasangan. **** P ＜0.0001.
Untu' ampa'le'baki anne passalaka, nigaukangi visualisasi SCLIM Gas1-GFP siagang Mid2-iRFP ri GhLag1 siagang alel mutan sensitif suhu sec31-1 (Gambara 4 siagang Film S4). Punna lebaki ER ni tahangi ri 37°C nampa nipasulu ri 24°C, sanna' jaina Gas1-GFP beru ni sintesis tena na ni kelompokkan siagang ni distribusikan ri sikontu membran ER, sangkamma ni cini' ri mikroskop konvensional (Gambara 4, A siagang B). Nampa pole, persentase lompo ERES (67%) antama tongi rua rupanna kargo niaka ri tangnga-tangngana (Gambara 4D). Panel 1 siagang 2 ri gambara 4C ampa'piitteang rua conto khas ERES siagang tumpang tindih Gas1-GFP siagang Mid2-GFP. Nampa pole, ruaya barang ni rekrut mange ri ERES yang sama (Gambara 4E, panel 3 siagang film S4). Jari, wassele'na ikatte ampa'nassai angkua la'buna rantai asil seramida ri membran ER iami antu penentu penting ri agregasi siagang klasifikasi protein ER.
Sel Sec31-1 GhLag1 yang mengekspresikan sekresi yang diinduksi galaktosa, Gas1-GFP (GPI-AP, hijau) dan Mid2-iRFP (TMP, biru) dan konstitutif ERES-berlabel Sec13-mCherry (ERES, magenta) Inkubasi pada 37°C. tulusu 30 menit, naung mange ri 24°C untuk ampasuluki sekresi, siagang gambara siagang SCLIM ribokoangna 20 menit. (A mange ri C) gambara proyeksi 2D representatif (A; skala bar, 1μm) atau gambara belahan sel 3D (B siagang C; unit skala, 0,45μm) battu ri 10 z-section ni tanrai ri kargo siagang ERES. Panel rawaya ri (B) siagang panel ri (C) ampa'piitteang gambara ni proses untu' ampa'piitteang bawang barang-barang niaka ri ERES (magenta) [Gas1-GFP (abu-abu) siagang Mid2-iRFP (biru ca'di)]. (C) Panah niisi pute: ERES, barang tumpang tindih. Panah tabbukka: ERES nia se'reji barang. Panel rawanganna: ERES nipilea nia barang tumpang tindih (1 siagang 2) ni tanrai ri (C). Bar skala, 100 nm. (D) Kuantifikasi fotomikrograf ni carita ri (C). Ri unit sec31-1 siagang sec31-1 GhLag1, se'reji kargo (Gas1-GFP atau Mid2-iRFP) nipantama, siagang persentase rata-rata ERES untuk kargo terisolasi siagang kargo tumpang tindih. Ri tallu paccoba independen, n = 432 ri 54 sel (sec31-1) siagang n = 430 ri 47 sel (sec31-1 GhLag1). Error bar = SD. Uji t dua ekor yang tidak berpasangan. *** P = 0.0002 (sec31-1) siagang ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) gambara 3D ERES nipile siagang kargo tumpang tindih (3) ni tanrai ri (C). Gas1-GFP (hijau) siagang Mid2-iRFP (biru) areppese mange ri ERES (magenta) battu ri se'reang sa'ri siagang ammantang ri se'reang tampa' ni batasi ERES. Bar skala, 100 nm.
Anne pa'pilajaranga assarei butti in vivo langsung angkua kargo protein berbasis lipid nipantama ri situs ekspor selektif ri jalur sekresi, siagang ampa'nyatai pentingna lantang rantai asil untuk selektifitas klasifikasi. Ammake teknik mikroskop kuat siagang canggih niarenga SCLIM, kipa'piitteang Gas1-GFP (membran plasma utama GPI-AP siagang bageang lipid seramida rantai asil (C26) sanna' la'buna) ri ragi) Daerah-daerah yang terkelompok dalam ER diskrit terkait dengan ERES spesifik, sementara protein transmembran terdistribusi melalui ERRES (Gambara 1). Nampa pole, anne ruaya rupanna barang antama ERES maraeng secara selektif (Gambara 2). Lantangna rantai asil seramida seluler ri membran ni kurangi battu ri C26 mange ri C18-C16, kluster Gas1-GFP ni ganggu mange ri wilayah ER diskrit, siagang Gas1-GFP ni rute poleang untu ambokoi ER siagang protein transmembran melalui ERES yang sama (Gambara 3 siagang Gambar 3). 4).
Manna pole GPI-AP a'pakei mekanisme protein khusus untu' assulu' battu ri ER, mingka nia'mo kicini' C26 ceramide-dependent separation tena na'gandeng ri interaksi protein diferensial nu'kullea a'jari ERES spesialisasi (Gambara S4 siagang S5). Mingka, pa'pauangta antulungi mekanisme pa'golongang alternatif ni dorong ri pa'rappungang protein berbasis lipid siagang pa'beserang kargo maraeng. Pa'paressata ampa'nassai angkua Gas1-GFP wilayah iareka kluster ni pasisambungang siagang ERES tertentu anre' na nia' protein sekresi transmembran Mid2-iRFP, nu'pa'piitteang angkua C26 ceramide-dependent GPI-AP cluster la'pa'sadiai antama'na ri ERES yang relevan, siagang ri wattu to'ji, ansulu'i transmembran Sekresi antama' ri ERES khusus anne (Gambara 2 siagang ERES). Sikontutojenna, nia'na C18-C16 ceramides ri membran ER tena na'jari saba' GPI-AP a'bentu' daera yareka kluster, jari tena na'kulle ansulu' yareka ansambeangi protein sekresi transmembran anjari ERES sangkamma (Gambara 3 siagang 4). . Jari, kipa'nassai angkua C26 ceramide angngerangi pa'bageang siagang pa'bageang na pa'sadia pa'rappungang protein nu ni pasisambungang siagang ERES spesifik.
Antekamma batena ampa'gannaki C26 ceramide-dependent clustering anjari area ER tertentu? Kecenderungan membran ceramide untuk terpisah secara lateral dapat menyebabkan GPI-AP dan C26 ceramide untuk membentuk lipid kecil dan tertib seketika di lingkungan lipid yang lebih tidak teratur dari membran ER yang mengandung glycerolipid yang lebih pendek dan tidak jenuh. Kelompok kualitas (17, 18). Anne gugus sementara ca'di akkullei nipa'se're mange ri gugus lompo, labbi stabil ribokoangna a'samaturu' mange ri kompleks p24 (34). Situru' siagang anne, kipa'piitteang angkua C26 Gas1-GFP parallui a'samaturu' siagang kompleks p24 untu' a'bentu' gugus lompoang (Gambara 3). Kompleks p24 iami antu oligomer heterozigot nibangung battu ri appa protein transmembran p24 yang berbeda ri ragi (35), yang menyediakan pengikatan multivalen, yang dapat menyebabkan pengikatan silang gugus GPI-AP kecil, sehingga menghasilkan gugus stabil yang lebih besar (34). Interaksi ektodomain protein GPI-APs akkulle tongi a'jari kontribusi ri agregasina, sangkamma ni pa'piitteang ri wattu transportasi Golgi ri sel epitel terpolarisasi mamalia (36). Mingka, punna C18-C16 ceramide niaki ri membran ER, punna p24 kompleks a'reppese' mange ri Gas1-GFP, kluster lompo tassa'la' tena na la'jari. Mekanisme yang mendasarinya mungkin bergantung pada sifat fisik dan kimia spesifik keramida rantai asil panjang. Studi biofisika membran buatan ampa'piitteangi angkua manna pole lantang (C24) siagang sike'de' (C18-C16) rantai asil keramida akkullei a'jari saba' pa'bageang fase, ceramida rantai asil lantang (C24) bawang akkulle ampa'jari tinggi lengkungan siagang film bending untu' a'bentu' poleang film. battu ri referensi massing-massing (17, 37, 38). Lebba ni pa'piitteang angkua heliks transmembran TMED2, homolog tau Emp24, a'samaturu' secara selektif siagang sphingomyelin berbasis ceramide C18 ri lobus sitoplasma (39). Pake simulasi dinamika molekuler (MD), ni gappai angkua C18 siagang C26 ceramides a'rappungang ri tammulilina lobus sitoplasma heliks transmembran Emp24, siagang rie' pa'minasanna sangkamma (Gambara S6). Parallui ni issengi angkua anne a'nassai angkua heliks transmembran Emp24 akkullei a'jari distribusi asimetris lipid ri membran. anne iami antu wassele beru ni dasarkan ri sel mamalia. Simulasi MD yang sama juga menunjukkan adanya lipid eter (40) . Jari, a'pikkiri angkua C26 ceramide ri ruaya lobule ER26 ni pa'gannaki secara lokal. Ri wattu GPI-AP ri lobus luminal langsung a'samaturu' mange ri multivalen p24 siagang akumulasi C26 ceramide ri tammulilina p24 ri lobus sitoplasma, akkullei na promosikan agregasi protein siagang kelengkungan membran ni pa'jari lalang jari-jari (41), na'jari GPI-AP a'sisa'la' mange ri daera-daera ta'bage-bage ri ampi'na ERES, ia to'ji tinggi lengkungna membran ER (42). Laporang rioloa antulungi mekanisme ni usulkanga (43, 44). Ikatan multivalen oligolektin, patogen atau antibodi ke glikosfingolipid berbasis seramida (GSL) pada membran plasma memicu agregasi GSL besar, meningkatkan pemisahan fase dan menyebabkan deformasi dan internalisasi membran (44). Iwabuchi dll. (43) Ni gappai angkua ri rie'na rantai asil lantang (C24) mingka anre' na sike'de' (C16), ligan multivalen ni ikat ri GSL laktosilseramida na induksi pa'bentukang kluster lompo siagang invaginasi membran, siagang transduksi sinyal sitoplasma Lyn-mediasi ri selebaran ni interdigitasi ri pasangan netropil.
Ri sel epitel terpolarisasi mamalia, konsentrasi jaringan anti-Golgi (TGN) mange ri tingka membran plasma apikal angkuasai pa'bageang siagang pa'bageang GPI-AP (10, 45). Anne agregasi ni sorong ri oligomerisasi GPI-AP (36), mingka akkulle tongi a'ganttung ri lantangna rantai seramida ni gappa ri ragi. Manna GPI-AP mamalia nia jangkar berbasis lipid eter, siagang struktur kimiana sanna sisalana battu ri rantai asil ceramida sanna lantangna, se're penelitiang beru-berua anre' na anggappai angkua ruaya lipid nia' sipa' fisik siagang kimia sangkamma siagang fungsina secara evolusioner (40). Jari, bageang lipid eter ri sel mamalia akkullei sangkamma C26 ceramide ri ragi, siagang peranna iamintu a'samaturu' siagang ceramide rantai lantang ri membran untu' ampa'la'bangi agregasi siagang penyortiran GPI-AP. Manna pole anne kasampatanga paralluiji niuji langsung, pa'pauang rioloa antulungi angkua pa'lettekang rantai asil lantang ceramida mange ri batang kale Golgi anre' na nigaukang ri protein pa'lettekang sitoplasma, mingka ta'ganttung ri sintesis jangkar GPI sangkamma ragi. Jari, mekanisme konservatif evolusioner sanna'i akkulle a'pile-pile co-transport rantai asil sanna' la'buna ceramide siagang GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) ri vesikel transportasi yang sama.
Ri sistem sel epitel terpolarisasi ragi siagang mamalia, agregasi GPI-AP siagang pemisahan battu ri protein membran plasma maraengannaya kajariang riolo ri tenanapa narapi tompo sel. Paladino et al. (48) nabuntulu angkua ri TGN sel epitel terpolarisasi mamalia, GPI-AP clustering teai bawang parallu untuk klasifikasi selektif GPI-APs mange ri membran plasma apikal, mingka atoro tongi organisasi clustering GPI-APs siagang aktivitas biologisna. Permukaan sel. Ri ragi, anne pa'pilajaranga ampa'piitteangi angkua C26 ceramide-dependent GPI-AP cluster ri ER akkullei angngatoro organisasi cluster siagang aktivitas fungsional GPI-AP ri membran plasma (24, 49). Situru siagang anne modele, sel GhLag1 alergi ri inhibitor GPI atau obat-obat yang mempengaruhi integritas dinding sel (28), siagang kebutuhang fungsional Gas1-GFP clusters (49) dari ujung seramida yang diproyeksikan dalam perkawinan sel ragi menunjukkan G Kemungkinan konsekuensi fisiologis sel hLag1. GPI-AP sala. Mingka, uji lanjutang maka organisasi fungsional permukaan sel lebba ni program battu ri ER siagang metode penyortiran berdasarkan lantang lipid iami antu subjek penelitianta ri allo riboko.
Strain Saccharomyces cerevisiae ni pake ri anne jama-jamang ni daftarkan ri Tabel S1. MMY1583 siagang MMY1635 strain SCLIM untuk pencitraan sel hidup nibangung ri latar belakang W303. Anne strain yang mengekspresikan Sec13-mCherry dengan tag protein fluoresen dibangun menggunakan metode berbasis reaksi berantai polimerase (PCR) dengan plasmid pFA6a sebagai template (23). Strain yang mengekspresikan Mid2-iRFP berlabel dengan protein fluoresen di bawah kendali promotor GAL1 dibangun seperti berikut. PCR amplifikasi urutan iRFP-KanMx battu ri vektor pKTiRFP-KAN (hadiah E. O'Shea, nomor plasmid Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; pengidentifikasi sumber daya penelitian (RRID): Addgene_64687) siagang nipantamaki ri endogenous C2. Punna lebaki urutan genom Mid2-iRFP ni amplifikasi siagang ni kloning anjari promotor GAL1, anjo nipantama ri situs Not I-Sac I plasmid integrasi pRS306. Plasmid pRGS7 yang dihasilkan dilinearkan dengan Pst I untuk terintegrasi ke lokus URA3.
Gen fusi Gas1-GFP ni ekspresikan ilalang kendali promotor GAL1 ri plasmid centromere (CEN), yang nibangung kamma anne. Urutan Gas1-GFP ni perkuat siagang PCR battu ri plasmid pRS416-GAS1-GFP (24) (hadiah L. Popolo) siagang ni kloning mange ri situs Xma I-Xho I plasmid CEN pBEVY-GL LEU2 (hadiah C). Miller; Nomor plasmid addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Plasmid nu ni gappa niarengi pRGS6. Gen fusi Axl2-GFP ni ekspresikan tongi ilalang kendali promotor GAL1 vektor pBEVY-GL LEU2, siagang konstruksina iamintu kamma anne. Urutan Axl2-GFP ni perkuat battu ri plasmid pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) siagang PCR, siagang ni kloning ri situs Bam HI-Pst I vektor pBEVY-GL LEU2. Plasmid nu ni gappa niarengi pRGS12. Urusang oligonukleotida ni pake ri anne pa'pilajaranga ni daftarkan ri tabel S2.
Strain ni tambai siagang 0,2% adenin siagang 2% glukosa [YP-dekstrosa (YPD)], 2% rafinosa [YP-rafinosa] ekstrak ragi kaya protein p (YP) medium (1% ekstrak ragi siagang 2% protein ept). (YPR)] atau 2% galaktosa [YP-galaktosa (YPG)] sebagai sumber karbon, atau dalam media minimal sintetis (0,15% basa nitrogen ragi dan 0,5% amonium sulfat) untuk menambahkan asam amino dan basa yang sesuai yang dibutuhkan untuk nutrisi, dan mengandung 2% glukosa glukosa (2% medium glukosa) atau media minimal galaktosa (medium minimal galaktosa sintetis) salaku sumber karbon.
Untuk pencitraan real-time, sel mutan sec31-1 sensitif suhu yang mengekspresikan konstruksi di bawah promotor GAL1 dikembangkan dalam media YPR pada 24°C semalam hingga fase mid-log. Punna lebaki induksi ri YPG ri 24°C 1 jam, sel-sel ni inkubasi ri SG ri 37°C 30 menit, nampa nipalette mange ri 24°C untu assulu battu ri blok sekresi. Concanavalin A ni pakei untu ampakabajiki sel-sel ri kaca slide siagang ni gambara ri SCLIM. SCLIM iami antu kombinasi mikroskop fluoresensi terbalik Olympus IX-71 siagang lensa minyak bukaan numerik UPlanSApo 100×1.4 (Olympus), pemindai konfokal cakram berputar tinggi-kecepatan dan rasio sinyal-ke-noise tinggi (Yokogawa Electric), spektrometer khusus, sistem kotomitor khusus siagang sistem pencitraan intensif (Hamamatsu Photonics) akkullei assarei sistem lensa pembesar siagang pembesaran akhir ×266.7 siagang kamera perangkat berpasangan muatan yang mengkalikan elektron (Hamamatsu Photonics) (21). Pa'gappa gambara nigaukangi ri perangkat lunak khusus (Yokogawa Electric). Untuk gambara 3D, kipakei aktuator piezoelektrik nipare' khusus untu' a'getar lensa objektif secara vertikal, siagang a'rappungang bageang optik 100 nm sisalana ri se'reang tumpukang. Gambara Z-stack nipinrai ajari data voxel 3D, siagang fungsi penyebaran titik teoritis ni pake untuk mikroskop konfokal cakram berputar ni pake untuk pemrosesan dekonvolusi ri perangkat lunak Volocity (PerkinElmer). siagang ammake perangkat lunak volocity untuk ambang batas otomatis untuk analisis co-location, ERES termasuk kargo ni ukkuru. Analisis pindai garis nigaukangi ammake perangkat lunak MetaMorph (Perangkat Molekuler).
Pakei perangkat lunak GraphPad Prism untuk ampattantui signifikansi statistik. Untuk uji t-Student rua-ekor siagang uji analisis varians searah biasa (ANOVA), sisalana kelompo' ni anggappai dampak signifikan ri P <0,05 (*).
Untuk mikroskop fluoresensi Gas1-GFP, sel fase log ni tumbuh sibulang ri YPD siagang ni pa'rappungang siagang sentrifugasi, ni cuci rua-rua siagang saline penyangga fosfat, siagang ni inkubasi ri es setidakna 15 menit, nampa ni lanjutkan ri mikroskop sangkamma lebaka ni carita riolo Cek (24). Mikroskop Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) ni pasadia siagang lensa objektif, filter L5 (GFP), kamera Hamamatsu siagang perangkat lunak Application Suite X (LAS X) ni pake untuk akuisisi. .
Sampel ni denaturasi siagang penyangga sampel SDS ri 65°C 10 menit, nampa nipisangkai siagang SDS-poliakrilamida gel elektroforesis (PAGE). Untuk analisis imunoblotting, 10 μl sampel ni muat per jalur. Antibodi primer: Pakei anti-Gas1 poliklonal kelinci ri pengenceran 1:3000, anti-Emp24 poliklonal kelinci ri pengenceran 1:500, siagang anti-GFP poliklonal kelinci (hadiah battu ri H. Riezman) ri pengenceran 1:3000. Antibodi anti-Pgk1 monoklonal tikus ni pakei ri pengenceran 1:5000 (hadiah battu ri J. de la Cruz). Antibodi sekunder: Peroksidase lobak (HRP) konjugasi kambing anti-kelinci imunoglobulin G (IgG) ni pake ri pengenceran 1:3000 (Pierce). HRP-konjugasi kambing anti-tikus IgG ni pakei ri pengenceran 1:3000 (Pierce). Zona tanggapan imun niparessai siagang metode chemiluminescence reagen SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Sangkamma ni carita ri (31), paccoba imunopresipitasi alami nigaukangi ri fraksi ER yang ni paenteng. Singkatanna, cuci sel ragi siagang penyangga TNE [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM campuran fenilmetilsulfonil fluorida siagang penghambat protease) ri 600 nm (OD600) ri 100 kepadatan optik rua kali. Anjo ni ancuruki siagang manik-manik kaca, nampa sisa-sisa sel siagang manik-manik kaca ni pasulu siagang sentrifugasi. Supernatan nampa ni sentrifugasi ri 17.000 g 15 menit ri 4°C. Pelet ni gantung poleang ri TNE siagang digitalis saponin ni tambai mange ri konsentrasi paccappureng 1%. Suspensi ni inkubasi 1 jam siagang rotasi ri 4°C, nampa komponen yang tena na larut ni pasulu siagang sentrifugasi ri 13.000 g ri 4°C 60 menit. Untuk imunopresipitasi Gas1-GFP, uru-uruna pra-inkubasi sampel siagang manik-manik agarose kosong (ChromoTek) ri 4°C selama 1 jam, nampa inkubasi siagang GFP-Trap_A (ChromoTek) ri 4°C selama 3 jam. Manik-manik imunopresipitasi ni cuci lima pissang siagang TNE niaka 0,2% digoxigenin, ni elusi siagang penyangga sampel SDS, nipisangkai ri SDS-PAGE, siagang ni analisis siagang imunoblotting.
Sangkamma ni carita ri (31), penentuan cross-linking nigaukangi ri fraksi ER yang diperkaya. Singkatna, fraksi ER yang diperkaya diinkubasi dengan 0,5 mM dithiobis(succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 min). Reaksi silang ni pamatei siagang nitambai glisin (50 mM konsentrasi akhir, 5 menit, 20°C).
Sangkamma lebaka nipau riolo (50), analisis MS ceramide ri tipe liar siagang strain GhLag1 nigaukangi. Singkatna, sel-sel ni tumbuh mange ri fase eksponensial (3 sanggenna 4 OD600 unit/ml) ri YPD ri 30°C, siagang 25×107 sel ni panen. Metabolismena ni pamatei siagang asam trikloroasetat. Pakei pelarut ekstraksi [etanol, je'ne', eter, piridin siagang 4,2 N amonium hidroksida (15:15:5:1:0,018 v/v)] siagang 1,2 nmol standar internal C17 ceramide (860517, Avanti polar lipid) kualitas). Pakei reagen monometilamin [metanol, je'ne', n-butanol siagang larutan metilamin (4:3:1:5 v/v)] untu' anggaukangi hidrolisis alkali ringan ekstrak, nampa pakei n-butanol jenuh je'ne' untu' ampasuluki garam. Paccappurenna, anjo ekstrak ni gantungi ammotere ri pelarut mode positif [kloroform/metanol/je'ne' (2:7:1) + 5 mM amonium asetat] nampa ni suntik ri spektrometer massa. Multi-reaksi monitoring (MRM) nigaukangi untuk identifikasi siagang kuantifikasi molekul sfingolipid. TSQ Vantage tersier quadrupole mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) ni pasadiai siagang robot nanoflow ion source Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) untuk analisis lipid. Energi tabrakan ni optimalkan untuk massing-massing kategori ceramide. Data MS niallei ri mode positif. Untuk massing-massing replikasi biologis, sinyal lipid iami antu median tallu pengukuran independen.
Sangkamma ni carita ri (31), sel (800×107) yang mengekspresikan Gas1-GFP nipantamai ri imunopresipitasi alami. Gas1-GFP yang dimurnikan dipisah oleh SDS-PAGE dan dipindahkan ke membran poliviniliden fluorida (PVDF). Protein ni cini'i siagang niwarnai PVDF siagang amida itang. Pita Gas1-GFP nikanre battu ri PVDF siagang nikanre 5 kali siagang metanol siagang sikali siagang je'ne' cair kromatografi-MS (LC-MS). siagang inkubasi strip membran siagang 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), penyangga siagang 500μl campurang natrium nitrit 1 M baru larut ri 37°C selama 3 jam, fraksi lipid ni lappassang battu ri Gas1-GFP siagang ni lysed Nilappassang infosofaosin ri alla'na glutefaosamin siagang seramin (51). Punna lebaki anjo, strip membran nikanre appa kali siagang je'ne' LC-MS, nikanre ri suhu kamara, nampa nipantama ri atmosfer nitrogen ri -80°C sa'genna ni analisis. Salaku kontrol, sampel kosong membran PVDF ni pakei untuk massing-massing paccoba. Lipid ni ekstrak battu ri Gas1-GFP nampa ni analisis ri MS sangkamma ni carita (50). Singkatna, strip PVDF niaka GPI-lipid ni suspensi ammotere ri 75μl pelarut cetakan negatif [kloroform/metanol (1:2) + 5 mM amonium asetat] siagang lulus ionisasi elektrospray (ESI)-MRM/MS Analisis spesies sphingolipid (TSQ Vantage). Ri anne passalaka, data MS niallei ri mode ion negatif.
Sangkamma lebaka nipau riolo, bageang lipid jangkar GPI nipisangkai battu ri [3H]-inositol-labeled GPI-AP (16). Lipid nipisangkai siagang kromatografi lapisan tipis ammake sistem pelarut (55:45:10 kloroform-metanol-0,25% KCl) siagang ni visualisasikan ammake FLA-7000 (Fujifilm).
Sel-sel yang mengekspresikan Gas1-GFP (600×107) dicuci dua kali dengan penyangga TNE dengan penyangga TNE, dan dipecah dengan manik-manik kaca, dan kemudian disentrifugasi untuk menghilangkan sisa-sisa sel dan manik-manik kaca. Supernatan nampa ni sentrifugasi ri 17.000 g 1 jam ri 4°C. Pelet nikanre ri TNE siagang ni inkubasi siagang 1 U PI-PLC (Invitrogen) ri TNE niaka 0,2% saponin digitalis 1 jam ri 37°C. Punna lebaki nigaukang perawatan enzim, membran ni pasulu siagang sentrifugasi ri 17.000 g ri 4°C 1 jam. Untu imunopresipitasi Gas1-GFP, supernatan ni inkubasi siagang GFP-Trap_A (ChromoTek) ri 4°C sibulang. Gas1-GFP yang dimurnikan dipisah oleh SDS-PAGE diwarnai dengan warna biru cemerlang Coomassie. Pita pewarnaan Gas1-GFP nikanre battu ri abu-abu niaka ri tammulilina akueduk, nampa ribokoangna alkilasi siagang iodoasetamida siagang reduksi siagang dithiothreitol, pencernaan in-gel siagang tripsin nigaukangi. Ekstrak siagang kering peptida triptik siagang peptida siagang GPI-glikan. Peptida kering ni larutkan ri 20 μl je'ne. Suntikkangi se're bageang (8μl) antama ri LC. Se're kolom octadecylsilane (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; diameter lalang 150 mm×1.0 mm; Nomura Chemical, Prefektur Aichi, Jepang) nipakei untu' ampasisa'laki peptida ilalang kondisi gradien tertentu. Fase mobile iami antu pelarut A (0,08% asam formik) siagang pelarut B (0,15% asam formik ri 80% asetonitril). Sistem Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) nipakei untu' ampa'le'baki kolom siagang pelarut A lalang 55 menit siagang laju aliran 50 μl min-1 lalang 5 menit, nampa konsentrasi pelarut B nitambai mange ri 40%. , Amerika Serikat). Eluat tulusu nipantama ri sumber ion ESI, siagang peptida tryptic siagang peptida siagang GPI-glikan ni analisis ri LTQ Orbitrap XL (spektrometer massa trap-orbitrap ion linier hibrida; Thermo Fisher Scientific). Ri pa'sadiaang MS, tegangan sumber kapiler nipasangi 4,5 kV, siagang suhu kapiler transfer nijagai ri 300°C. Tegangan kapiler siagang tegangan lensa tabung nipasang 15 V siagang 50 V, massing-massing. Data MS niallei ri mode ion positif (resolusi 60.000; akurasi massa 10 bageang per juta) ri rentang massa 300/m/z rasio massa/muatan (m/z) 3000. Data MS/MS niallei battu ri perangkap ion ri LTQ Orbit [XL), data uru-uruna tagantung ri digit, tabrakan induksi dissosiasi (CID)].
Simulasi MD nigaukangi ammake perangkat lunak GROMACS (52) siagang medan gaya MARTINI 2 (53-55). CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) nampa nipake untu ambangung lapisan ganda niaka dioleoilfosfatidilkolin (DOPC) siagang Cer C18 atau DOPC siagang Cer C26. Topologi siagang koordinat Cer C26 niallei battu ri DXCE siagang angngallei manik-manik tambahan battu ri ekor sfingosin. Pakei proses ni carita ri yawa untu' ampa'se'rei lapisi' dobel siagang pa'jappai, nampa pakei koordinat kala'busang sistem untu' ambangung sistem niaka Emp24. Domain transmembran ragi Emp24 (residu 173 sanggenna 193) nibangung salaku α-heliks ammake struktur molekuler alat visual MD (VMD) (58). Nampa, ribokoangna nipasulu lipid tumpang tindih, protein ni granulasi kasar siagang nipantama ri lapisan ganda ammake CHARMM GUI. Sistem paccappureng nia 1202 DOPC siagang 302 Cer C26 atau 1197 DOPC siagang 295 Cer C18 siagang Emp24. Ionisasi sistem mange ri konsentrasi 0.150M. Eppa replika independen ni paenteng untuk rua komposisi bilayer.
Lapisan ganda lipid ni seimbangkan menggunakan proses CHARMM GUI, yang melibatkan meminimalkan dan kemudian menyeimbangkan 405.000 langkah, di mana kendala posisi bertahap dikurangi dan dihilangkan, dan langkah waktu ditambahkan dari 0,005 ps menjadi 0,02 ps. Punna lebaki ni pa'se're, iami antu appa'nia 6 μs siagang langkah wattu 0.02 ps. Punna lebaki antama Emp24, pakei proses GUI CHARMM yang sama untuk meminimalkan dan menyeimbangkan sistem, kemudian menjalankan 8 s dalam produksi.
Untuk sikontu sistem, ri wattu proses penyeimbangan, tekanan ni kontrol ri barostat Berendsen (59), siagang ri wattu proses produksi, tekanan ni kontrol ri barostat Parrinello-Rahman (60). Ri sikontuna kasus, tekanan rata-rata iamintu 1 bar siagang skema kopling tekanan semi-isotropik nipake. Ri laleng proses keseimbangan siagang produksi, termostat (61) siagang kalibrasi ulang kecepatan ni pakei untu' a'pasang suhu protein, lipid siagang partikel pelarut massing-massing. Ri wattu operasi, suhu target iamintu 310K. Interaksi non-bonding nirekengi siagang appa'nia' daftar pasangan ammake skema Verlet siagang toleransi penyangga 0,005. Istilah Coulomb nirekengi ammake medan reaksi siagang jarak potong 1,1 nm. Istilah Vander Waals a'pakei skema cut-off siagang jarak cut-off 1,1 nm, siagang skema cut-off Verlet nipakei untuk potensi drift (62).
Pake VMD, panjang gelombang cutoff antara manik-manik fosfat DOPC atau manik-manik ceramida AM1 siagang protein iamintu 0,7 nm, siagang jumlah lipid yang berinteraksi dengan protein dihitung. Situru rumus ribokoangna, hitung faktor depletion-enrichment (DE) sangkamma ri (63): faktor DE = (jumlah total lipid ri protein 0,7) ri protein 0,7 (jumlah Cer ri total lipid)
Nilai yang dilaporkan diperoleh sebagai rata-rata, dan bilah kesalahan adalah empat salinan independen dari SE. Signifikansi statistik faktor DE nirekengi siagang uji t [(rata-rataDE-faktor-1)/SE]. Nirekengi nilai P battu ri distribusi se're ekor.
Alat GROMACS ni pakei untuk anghitung peta kepadatan lateral 2D sistem yang mengandung Emp24 dalam 250 ns terakhir jejak. Untu anggappa peta pengayaan/pengurangan ceramide, peta kepadatan Cer ni bagi siagang jumlah peta Cer siagang DOPC, nampa ni bage siagang konsentrasi Cer ri tubua. Skala peta warna yang sama digunakan.
Untuk bahan tambahan untuk artikel ini, silahkan lihat http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
anne iami antu artikel akses terbuka ni distribusikan ri sesena paratorang Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, yang memungkinkan penggunaan, distribusi dan reproduksi dalam media apa pun, asalkan penggunaan terakhir tidak untuk keuntungan komersial dan premisnya adalah bahwa karya aslinya benar. Referensi.
Catatang: Ikatte appalakki bawang ri kau sollanna nupassareang alamat emailnu sollanna tau nu rekomendasikan mange ri halamanga naisse'i angkanaya ero'nu nacini' emailnu siagang teai spam. Ikatte tena na la angngalle alamat email.
anne pakkuta'nang ni pakei untu' anuji punna ikatte tau battu siagang anjagai pa'sareang spam otomatis.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Lingio Serero), Lopez Lopez (Serhopez), (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D pencitraan real-time resolusi tinggi ampa'nyatai pentingna lantangna rantai ceramide untuk pa'bageang protein ri situs output selektif.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Lingio Serero), Lopez Lopez (Serhopez), (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D pencitraan real-time resolusi tinggi ampa'nyatai pentingna lantangna rantai ceramide untuk pa'bageang protein ri situs output selektif.
©2020 Asosiasi Amerika untuk Kemajuan Sains. sikontu ha'na nijaga. AAAS iami antu pa'samaturukang HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef siagang COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.