Kamma kammayya anne *Alamat kamma kammayya anne: Cologne 50931, Jerman, Cologne Penelitian Klaster Keunggulan tentang Respon Stres Seluler dalam Penyakit Terkait Penuaan (CECAD).
Neurodegenerasi garring mitokondria ni anggap tena nakkulle nipinra nasaba plastisitas metabolisme neuron terbatas, mingka efek disfungsi mitokondria ri otonomi sel metabolisme neuron ri tubua kurang nipahangi. Anrinni, kipa'issengangi proteom spesifik sel neuron Purkinje siagang defisiensi OXPHOS progresif nasaba' dinamika fusi mitokondria terganggu. Ikatte anggappai disfungsi mitokondria na pa'jari beru ri bidang proteomik, yang kala'busanna na pa'jari aktivasi berurutan program metabolisme yang tepat riolo kematian sel. Tena na sanna-sanna, ikatte ampattantui induksi yang jelas battu ri piruvat karboksilase (PCx) siagang enzim anti-aging maraengannaya yang antambai perantara siklus TCA. Inhibisi PCx na pa'jari stres oksidatif siagang neurodegenerasi, a'nassai angkua aterosklerosis nia' efek pelindungna ri neuron yang kurang OXPHOS. Pammolleang fusi mitokondria ri neuron degeneratif terminal sukkuki napinra sipa' metabolisme anne, sa'genna anre' na'kulle mate sel. Temuan ikatte ampa'nassai jalur-jalur yang tenayapa ni isse' riolo yang assarei ketahanan ri disfungsi mitokondria siagang ampa'piitteangi angkua neurodegenerasi akkullei nipinra manna pole ri tahap pa'le'ba'na garringa.
Peran sentral mitokondria ri laleng ampaentengi metabolisme energi saraf ni tekankan ri gejala neurologis yang luas terkait dengan penyakit mitokondria manusia. Sikontu garringa anne nasaba mutasi gen yang mengatur ekspresi gen mitokondria (1, 2) atau penghancuran gen terkait dinamika mitokondria, yang secara tidak langsung mempengaruhi stabilitas DNA mitokondria (mtDNA) (3, 4). Pa'jamaang ri modele olo'-olo' ampa'piitteangi angkua ri pa'balasa'na disfungsi mitokondria ri jaringang ri tammulilina, jalur metabolisme konservatif (5-7) akkullei ni aktifkan, nu assarei informasi penting untuk pa'pahang antama' ri patogenesisna anne garring kompleks. Sikontutojenna, pahangta ri sesena pa'pinraang metabolisme ri sesena sel tertentu nasaba' kagagala'na produksi adenosin trifosfat (ATP) mitokondria otak iami antu poko' (8), ampa'nassai parallua niidentifikasi target terapeutik nu'kullea nipake untu' anjagai iareka anjagai garring. Cegah neurodegenerasi (9). Kurangna informasi iami antu fakta sel saraf ni anggap secara luas memiliki fleksibilitas metabolisme yang sangat terbatas dibandingkan dengan jenis sel jaringan di sekitarnya (10). Nasaba sel-sel anne a'kulle a'jari peran sentral ri laleng a'koordinasi pasokan metabolit mange ri neuron untu' ampa'la'bangi transmisi sinaptik siagang a'bali' bicara ri kondisi cedera siagang garring, pakkulle untu' a'adaptasi metabolisme sel mange ri kondisi tantangan jaringan otak a'reppese'i ri sel glial (11-14). Nampa pole, heterogenitas seluler yang melekat ri jaringan otak sanna'i na halangi pa'pilajarang ri sesena pa'pinraang metabolisme yang kajariang ri subkelompok neuronal tertentu. Hasilna, sike'de'ji ni isse' ri sesena konsekuensi seluler siagang metabolisme yang tepat battu ri disfungsi mitokondria ri neuron.
Untu' ampahangi konsekuensi metabolisme disfungsi mitokondria, ni isolasi neuron Purkinje (PNs) ri tahap degenerasi neuro yang berbeda-beda nasaba' ancuru'na fusi membran luar mitokondria (Mfn2). Manna mutasi Mfn2 ri rupataua assisompungenna siagang se're bentu' neuropati sensorik motorik turun-temurun niarenga Charcot-Marie-Tooth tipe 2A (15), pa'ancurukang kondisional Mfn2 ri tikus iami antu metode disfungsi induksi fosforilasi oksidasi (OXPHOS) yang ni isse' baji'. Sikamma subtipe neuronal (16-19) siagang fenotipe neurodegeneratif yang dihasilkan disertai oleh gejala neurologis progresif, seperti gangguan gerakan (18, 19) atau ataksia serebelum (16). siagang ammake kombinasi proteomik kuantitatif bebas label (LFQ), metabolomik, pencitraan, siagang metode virologis, kipa'piitteang angkua neurodegenerasi progresif sanna' na induksi piruvat karboksilase (PCx) siagang faktor-faktor maraeng yang terlibat ri arteriosklerosis PNs in vivo Ekspresi enzim. Untu' ampa'nassai relevansina anne pa'boyanga, ikatte secara khusus na down-regulate ekspresi PCx ri Mfn2-deficient PNs, siagang nigappai angkua anne operasi napa'jari stres oksidatif siagang napa'jari pila' gassing neurodegenerasi, sa'genna a'butti angkua azoospermia assarei kamateang sel Kemampuan adaptasi metabolisme. Ekspresi parah MFN2 akkullei sukku' ampasalamaki degenerasi terminal PN siagang defisiensi OXPHOS parah, konsumsi massal DNA mitokondria, siagang jaringan mitokondria yang sanna' rusakna, yang lebih menekankan bahwa bentu' neurodegenerasi anne akkullei a'jari baji' poleang ri tahap lanjutna garringa riolo matena sel.
Untu' ampa'cinikang mitokondria ri Mfn2 knockout PNs, nipakei strain tikus nu'kullea mitokondria Cre-dependent untu' antargetkan protein fluoresen kuning (YFP) (mtYFP) (20) ekspresi Cre siagang niparessai morfologi mitokondria in vivo. Ikatte anggappai angkua ancuru gen Mfn2 ri PNs na anjari pa'bageang bertahap ri jaringan mitokondria (Gambara S1A), siagang beru beru ni gappai ri umuru 3 minggu. Sikontutojenna, degenerasi substansial lapisang sel PN, sangkamma ni buktikan ri kala'busang imunostaining Calbindin, tena na appakkaramula sanggenna umuru 12 minggu (Gambara 1, A siagang B). Tena nacocok wattu ri alla'na pa'pinraang rioloa ri morfologi mitokondria siagang pammulangna kamateang neuron yang nicini' na dorongi ikatte untu' ansalidiki pa'pinraang metabolisme ni picu ri disfungsi mitokondria riolo kamateang sel. Ikatte ampaentengi strategi berbasis fluoresensi-activated cell sorting (FACS) untuk angngisolasi YFP (YFP+)-expressing PN (Gambara 1C), siagang ri tikus kontrol (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), ribokoangna nikana CTRL (Gambara S1BRL). Optimasi strategi gating berdasarkan intensitas relatif sinyal YFP memungkinkan kita untuk memurnikan tubuh YFP+ (YFPhigh) PN dari non-PN (YFPneg) (Gambar S1B) atau fragmen akson/dendritik fluoresen putatif (YFPlow; Gambar S1D, kiri), dikonfirmasi oleh mikroskop konfokal (Gambar S1D, kanan). Untu' ampa'nassai identitas populasi ni golongang, nigaukangi proteomik LFQ nampa analisis komponen poko', siagang nigappai angkua rie' pa'bageang je'ne' ri YFPhigh siagang sel YFPneg (Gambara S1C). Sel YFPhigh ampa'piitteangi pengayaan bersih penanda PNs yang diketahui (iamintu Calb1, Pcp2, Grid2 dan Itpr3) (21, 22), tetapi tidak pengayaan protein yang biasa diekspresikan dalam neuron atau jenis sel lainnya (Gambar 1D) ). Pa'bandingang sampel ri sel YFPhigh ni golongang ni pa'rappungang ri paccoba independen ampa'piitteang koefisien korelasi> 0,9, ampa'piitteang reproduksi baji' ri pa'replikasi biologis (Gambara S1E). Ri pa'pau singkamma, anne dataya na validasi rencanata untuk isolasi akut siagang spesifik PN yang layak. Nasaba sistem driver L7-cre ni pake na induksi rekombinasi mosaik ri minggu maka se're ribokoangna allassukang (23), appakkaramulami ikatte ambunoi tikus battu ri CTRL siagang kondisional (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Pa'rappungang neuron. Punna lebaki rekombinasi, nikana Mfn2cKO ri umuru 4 minggu. Sangkamma titik paccappureng, nipilei 8 minggu umuru ri wattu lapisi PN utuh manna pole fragmentasi mitokondria yang jelas (Gambara 1B siagang Gambara S1A). Sikontu-kontuna, ni ukkuru 3013 protein, battu ri anjo kira-kira 22% ni dasarkangi ri anotasi MitoCarta 2.0 ni dasarkangi ri proteom mitokondria salaku mitokondria (Gambara 1E) (Gambara 1E) (24). Analisis ekspresi gen diferensial yang dilakukan pada minggu 8 menunjukkan bahwa hanya 10,5% dari semua protein memiliki perubahan signifikan (Gambar 1F dan Gambar S1F), dari mana 195 protein diatur turun dan 120 protein diatur nai (Gambar 1F). Parallui ni issengi angkua “analisis jalur inovatif” battu ri anne set data ampa'piitteangi angkua gen yang ni ekspresikan secara berbeda terutama antama ri set terbatas jalur metabolisme tertentu (Gambara 1G). Na menarikna, manna pole na downregulasi jalur terkait OXPHOS siagang sinyal kalsium napa'nassai induksi disfungsi mitokondria ri PN defisiensi fusi, kategori maraeng yang utamana antama'i metabolisme asam amino signifikan ni atur, yang sejalan siagang metabolisme yang terjadi ri PN mitokondria Rewiring konsisten. gangguan fungsi.
(A) Foto konfokal representatif bageang serebelum tikus CTRL siagang Mfn2cKO ampa'piitteang rugi PNs (calbindin, abu-abu); inti ni lawan siagang DAPI. (B) Kuantifikasi (A) (analisis varians satu arah, ***P<0,001; n = 4 hingga 6 lingkaran dari tiga tikus). (C) Alur kerja eksperimental. (D) Distribusi peta panas penanda khusus Purkinje (atas) siagang jenis sel maraengannaya (tengah). (E) Diagram Venn ampa'piitteang jaina protein mitokondria ni identifikasi ri PN ni golongang. (F) Plot gunung berapi protein yang diekspresikan secara berbeda di neuron Mfn2cKO pada 8 minggu (nilai cut-off signifikansi 1,3). (G) Analisis jalur kreativitas ampa'piitteangi lima jalur up-regulasi (merah) siagang down-regulasi (biru) kaminang parallu ri Mfn2cKO PN nigolongang 8 minggu. Rata-rata tingka ekspresi massing-massing protein yang nideteksi ni pa'piitteang. Peta panas skala abu-abu: nilai P yang disesuaikan. ns, tena naparallu.
Data proteomik ampa'piitteangi angkua ekspresi protein kompleks I, III, siagang IV anre' na'kulle niurangi. Kompleks I, III, siagang IV ngaseng nia subunit mtDNA-encoded esensial, sementara kompleks II, yang hanya berkode nuklir, pada dasarnya tidak terpengaruh (Gambar 2A dan Gambar S2A). . Situru siagang wassele proteomik, imunohistokimia bageang jaringan serebelum ampa'piitteangi angkua MTCO1 (mitokondria sitokrom C oksidase subunit 1) tingka' subunit kompleks IV ri PN sanna'mi ancuru'na (Gambara 2B). Subunit Mtatp8 yang dikodekan mtDNA secara signifikan berkurang (Gambar S2A), sementara tingkat keadaan mantap subunit ATP sintase yang dikodekan nuklir tetap tidak berubah, yang konsisten dengan kompleks subrakitan F1 ATP sintase stabil yang diketahui ketika ekspresi mtDNA stabil. Pabentukanna konsisten. Ganggu (7). Evaluasi tingka mtDNA ri Mfn2cKO PNs ni urusi siagang reaksi berantai polimerase real-time (qPCR) napa'butti panra'na nomor salinan mtDNA. Punna nipasibandingi siagang kelompok kontrol, ri umuru 8 minggu, kira-kira 20% bawang battu ri tingka mtDNA ni pertahankang (Gambara 2C). Situru' siagang anne wassele'na, pewarnaan mikroskop konfokal Mfn2cKO PNs nipakei untu' angngassengi DNA, ampa'piitteangi konsumsi nukleotida mitokondria ta'ganttung ri wattu (Gambara 2D). Ikatte anggappai angkua rie'ja siapa are kandidat yang terlibat dalam degradasi protein mitokondria siagang tanggapang stres ni atoroki, antama tongi Lonp1, Afg3l2 siagang Clpx, siagang faktor perakitan kompleks OXPHOS. Tena na rie' pa'pinraang signifikan ri tingka' protein yang terlibat ri apoptosis nideteksi (Gambara S2B). Kammayatompa, nia'mo kicini' mitokondria siagang saluran retikulum endoplasma yang terlibat dalam transportasi kalsium memiliki perubahan kecil (Gambar S2C). Nampa pole, evaluasi protein terkait autofagi tena na rie' pa'pinraang signifikan, yang konsisten siagang induksi autofagosom yang ni cini' ni cini' ri vivo ri imunohistokimia siagang mikroskop elektron (Gambara S3). Mingka, disfungsi OXPHOS progresif ri PNs ni dampingi siagang perubahan mitokondria ultrastruktural yang jelas. Gugus mitokondria akkullei ni cini' ri batang kale siagang poko' dendritik Mfn2cKO PNs umuru 5 siagang 8 minggu, siagang struktur membran batinna le'ba'mi a'pinra lompo (Gambara S4, A siagang B). Situru' siagang anne pa'pinraang ultrastruktur siagang panra'na mtDNA, analisis irisan otak akut siagang ester metil tetrametilrodamin (TMRM) ampa'piitteangi angkua potensi membran mitokondria ri Mfn2cKO PNs panra'na signifikan (Gambara S4C).
(A) Analisis kursus waktu tingkat ekspresi kompleks OXPHOS. Pertimbangkanji bawang protein siagang P<0.05 ri 8 minggu (ANOVA dua arah). Garis titik-titik: Tena pannangkasia punna nipasibandingi siagang CTRL. (B) Kiri: Conto bageang otak ni cappa siagang antibodi anti-MTCO1 (bar skala, 20 μm). Daera nipantama ri tubuna sel Purkinje nitutui siagang warna kuning. Kanang: Kuantifikasi tingka MTCO1 (analisis varians searah; n = 7 sanggenna 20 sel ni analisis battu ri tallu tikus). (C) analisis qPCR nomoro salinan mtDNA ri PN ni urusi (analisis varians searah; n = 3 sa'genna 7 tikus). (D) Kiri: Se're conto irisan serebelum ni label siagang antibodi anti-DNA (bar skala, 20 μm). Daera nipantama ri tubuna sel Purkinje nitutui siagang warna kuning. Kanang: Kuantifikasi lesi mtDNA (analisis varians searah; n = 5 sa'genna 9 sel battu ri tallu tikus). (E) Se're conto bageang serebelum akut ampa'piitteang mitoYFP + sel Purkinje (panah) ri rekaman penjepit patch sel-seluruh. (F) Kuantifikasi kurva IV. (G) Rekaman perwakilan injeksi arus depolarisasi ri sel CTRL siagang Mfn2cKO Purkinje. Jejak atas: pulsa pertama yang memicu AP. Jejak rawanganna: frekuensi AP maksimal. (H) Kuantifikasi input spontan postsinaptik (sPSPs). Jejak rekaman perwakilan siagang rasio zoomna ni pa'piitteang ri (I). Analisis varians se're arah ni analisis n = 5 sanggenna 20 sel battu ri tallu tikus. Data ni pa'piitteang salaku rata-rata±SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Jejak perwakilan AP spontan yang dicatat menggunakan mode penjepit tambal berlubang. Jejak atas: frekuensi AP maksimal. Jejak rawa: zoom se're AP. (K) Angngukkuruki frekuensi AP rata-rata siagang maksimal situru (J). Mann-Whitney test; n = 5 sel ni analisis battu ri appa tikus. Data ni pa'piitteang salaku rata-rata±SEM; tena naparallu.
Kerusakan OXPHOS yang jelas dideteksi di 8-minggu-umur Mfn2cKO PN, menunjukkan bahwa fungsi fisiologis neuron parah abnormal. Jari, kiparessai sipa' listrik pasif neuron kurang OXPHOS ri 4 sa'genna 5 minggu siagang 7 sa'genna 8 minggu siagang anggaukangi rekaman penjepit tambalan sel seluruh ri irisan serebelum akut (Gambara 2E). Tena nasanna-sanna, potensi membran istirahat rata-rata siagang resistensi masukan neuron Mfn2cKO sangkammai siagang kontrol, manna mamo rie' sisalana halus ri alla'na sel (Tabel 1). Kammayatompa, ri umuru 4 sa'genna 5 minggu, tena na rie' pa'pinraang signifikan ri hubungang arus-tegangan (kurva IV) ni gappa (Gambara 2F). Mingka, tena neuron Mfn2cKO 7 sa'genna 8 minggu umuru'na attahang ri rejimen IV (langkah hiperpolarisasi), a'nassai angkua rie' sensitivitas je'ne' ri potensi hiperpolarisasi ri tahap ribokoangna. Sikontutojenna, ri neuron Mfn2cKO, arus depolarisasi yang menyebabkan debit potensial aksi berulang (AP) ditoleransi dengan baik, menunjukkan bahwa pola debit keseluruhannya tidak signifikan berbeda dengan neuron kontrol 8-minggu (Tabel 1 dan Gambar 2G). Kammayatompa, frekuensi siagang amplitudo arus postsinaptik spontan (sPSCs) sangkammai siagang kelompok kontrol, siagang frekuensi kajadian nai' battu ri 4 minggu mange ri 5 minggu mange ri 7 minggu mange ri 8 minggu siagang nai' sangkamma (Gambara 2, H siagang I). Periode pematangan sinaptik ri PNs (25). Hasil yang sama diperoleh setelah tambalan PNs berlubang. Anne konfigurasi anjagai kasampatang kompensasi cacat ATP seluler, sangkamma akkullea kajariang ri rekaman penjepit patch sel seluruh. Khususna, potensi membran istirahat siagang frekuensi penembakan spontan neuron Mfn2cKO tena na ni pengaruhi (Gambara 2, J siagang K). Ri pa'pau singkamma, anne wassele'na a'pa'piitteang angkua PNs siagang disfungsi OXPHOS yang jelas akkullei a'tahang baji' ri pola debit frekuensi tinggi, a'pa'piitteang angkua rie' mekanisme kompensasi nu'kullea ampa'kulleangi ke'nanga ampa'tarrusui tanggapang elektrofisiologis nu'kullea a'reppese'-normal.
Data ni pa'piitteang salaku rata-rata ± SEM (analisis varians se're arah, uji perbandingan ganda Holm-Sidak; *P<0.05). nomoro satuan ni tanra ri kurung.
Ikatte alampa mange ri ansalidiki punna rie' kategori ri dataset proteomik (Gambara 1G) antama'i jalur nu'kullea angngewai defisiensi OXPHOS parah, na'kulle ampakasingaraki angngapa na PN nu'kullea ampa'tarrusui elektrofisiologi nu'kullea a'reppese'-normal (Gambara 2, E mange ri K). . Analisis proteomik ampa'piitteangi angkua enzim yang terlibat ri katabolisme asam amino rantai bercabang (BCAA) signifikan ni atur (Gambara 3A siagang Gambar S5A), siagang produk akhir asetil-CoA (CoA) atau suksinil CoA akkullei natambai trikarboksilat ri siklus Asam arteriosklerosis (TCA). Ikatte anggappai angkua kanre BCAA transaminase 1 (BCAT1) siagang BCAT2 massing-massing natambai. Iamintu na katalisis langkah maka se're katabolisme BCAA siagang appa'nia' glutamat battu ri α-ketoglutarate (26). Sikontu subunit nu a'bentu' rantai bercabang keto asam dehidrogenase (BCKD) kompleks ni atur (kompleks a'katalisis dekarboksilasi ribokoangna siagang anre' na'kulle nipinra battu ri rangka karbon BCAA nu'kullea) (Gambara 3A siagang Gambara S5A). Mingka, tena na rie' pa'pinraang mannannungang ri BCAA kalenna ni gappa ri PN ni urusi, nu'kullea nasaba' pa'naikanna pa'se'reang seluler asam amino esensial iareka pa'pakeang sumber maraeng (glukosa iareka asam laktat) untu' ampa'gannaki siklus TCA (Gambara S5B). PNs yang kurang OXPHOS juga menunjukkan peningkatan dekomposisi glutamin dan aktivitas transaminasi pada 8 minggu usia, yang dapat dicerminkan oleh up-regulasi enzim mitokondria glutaminase (GLS) dan glutamin piruvat transaminase 2 (GPT2) (Gambar 3, A dan C). Parallui ni issengi angkua up-regulation GLS ni batasi ri isoform glutaminase C (GLS-GAC) (pinra Mfn2cKO/CTRL kira-kira 4,5-kali lipat, P = 0,05), siagang up-regulasi spesifikna ri jaringan kanker akkullei na bantu bioenergi mitokondria. (27).
(A) Peta panas ampa'piitteangi pa'pinraang lipatan ri tingka' protein untuk rute ni tentukan ri 8 minggu. (B) Conto irisan serebelum ni label siagang antibodi anti-PCx (skala bar, 20 μm). Panah kuning a'tuju mange ri batang kale sel Purkinje. (C) Analisis ekspresi protein lalang wattu ni identifikasi salaku kandidat penting untuk aterosklerosis (uji t berganda, *FDR <5%; n = 3-5 tikus). (D) Ri dallekang: Diagram skematik nu ampa'piitteang cara-cara maraeng antama' ri karbon ni label niaka ri [1-13C] pelacak piruvat (iamintu, ilalang PDH atau rute trans-arteri). Ri bageang rawa: Bagan biola ampa'piitteangi persentase karbon berlabel tunggal (M1) nipinra a'jari asam aspartat, asam sitrat siagang asam malat ribokoangna ni label irisan serebelum akut siagang [1-13C] piruvat (uji t berpasangan; ** P <0,01). (E) Analisis sejarah waktu komprehensif ri jalur yang ditunjukkan. Pertimbangkanji bawang protein siagang P<0.05 ri 8 minggu. Garis putus-putus: tena nilai penyesuaian (analisis varians dua arah; * P <0,05; *** P <0,001). Data ni pa'piitteang salaku rata-rata±SEM.
Ri pa'pilajarangta, katabolisme BCAA a'jari sala se're jalur up-regulasi kunci. Anne faktaya sanna'i na pa'piitteang angkua volume ventilasi antama' ri siklus TCA akkullei nipinra ri PN kurang OXPHOS. anne akkullei a'jari se're bentu' lompo ri rewiring metabolisme neuronal, nu'kullea a'jari dampak langsung ri fisiologi neuronal siagang kelangsungan hidup ri wattu pa'jagaang disfungsi OXPHOS parah. Situru siagang hipotesis anne, nigappai angkua enzim anti-aterosklerotik utama PCx ni atoroki (Mfn2cKO/CTRL a'pinra kira-kira 1,5 kali; gambara 3A), nu a'katalisis konversi piruvat mange ri oksaloasetat (28), nu ni tappaki ri jaringan otak ekspresi astrosis ni batasi (29, 30). Situru siagang wassele proteomik, mikroskop konfokal ampa'piitteangi angkua ekspresi PCx secara khusus siagang signifikan nai' ri PNs kurang OXPHOS, sementara reaktivitas PCx terutama ni batasi ri sel glial Bergmann ri ampi'na kontrol (Gambara 3B). Untu' angnguji secara fungsional upregulasi PCx yang diamati, kami merawat irisan serebelum akut dengan [1-13C]pyruvate tracer. Ri wattu piruvat ni oksidasi ri piruvat dehidrogenase (PDH), label isotopna tappela, mingka nipantama ri perantara siklus TCA ri wattu piruvat ni metabolisme ri reaksi vaskular (Gambara 3D). Untu' antulungi data proteomikta, nia'mo nicini' jai sikali penanda battu ri anne tracer ri asam aspartat irisan Mfn2cKO, sementara asam sitrat siagang asam malat nia' tongi trend moderat, manna mamo tena na signifikan (Gambara 3D).
Ri neuron dopamin tikus MitoPark siagang disfungsi mitokondria nasaba neuron dopamin secara khusus ancuruki gen faktor transkripsi mitokondria A (Tfam) (Gambara S6B), ekspresi PCx signifikan tongi ni atoroki (31), a'nassai angkanaya arteriosklerosis asam aseton Kajarianna anjo garringa ni atoroki ri wattu disfungsi neuron OXPHOS ri batang kale. Parallui ni issengi angkua rie'mo nigappai enzim unik (32-34) yang akkulle ni ekspresikan ri neuron yang akkulle ni kaitkan siagang arteriosklerosis signifikan ni atur ri PN yang kurang ri OXPHOS, pappada propionyl-CoA karboksilase (PCC-A), Malonyl-CoA a'pinra propionyl-CoA mitoconyl-CoA siagang succic-A-CoA enzim 3 (ME3), yang peran utamanya adalah untuk memulihkan piruvat dari malat (Gambar 3, A dan C) (33, 35). Nampa pole, nia’mo nigappa pa’naikang signifikan ri enzim Pdk3, ia a’fosforilasi siagang a’jari inaktif PDH (36), nampa tena nideteksi pammopporang ri enzim Pdp1 a’jari aktif PDH yareka kompleks enzim PDH tonji (Gambar 3A). Konsisten, ri Mern2cKO PNs, fosforilasi α1 subunit α (PDHE1α) subunit piruvat dehidrogenase E1 komponen kompleks PDH ri Ser293 (niisseng akkulle anghalangi aktivitas enzim PDH) ni tambai (Gambara S6C) (Gambara S6C). Piruvat tena akses pembuluh darah.
Paccappurenna, nigappami angkanaya jalur super biosintesis serin siagang glisin, siklus folat mitokondria (1C) terkait siagang biosintesis prolin (Gambara 1G siagang Gambar S5C) yangasenna signifikan ni atoroki, situru laporang, ri wattu proses aktivasi. Jaringan ri tammulilina ni aktifkan siagang disfungsi mitokondria (5-7). Analisis konfokal yang mendukung data proteomik ini menunjukkan bahwa di PN dengan OXPHOS hilang, irisan serebelum tikus 8-minggu-umur dikenakan serine hidroksimetiltransferase 2 (SHMT2), enzim kunci siklus folat mitokondria. Respon imun yang signifikan (Gambara S5D). Ri 13 CU-glukosa-inkubasi irisan serebelum akut, eksperimen pelacakan metabolisme lebih lanjut mengkonfirmasi up-regulasi biosintesis serin dan prolin, menunjukkan bahwa fluks isoform karbon menjadi serin dan prolin meningkat (Gambar S5E). Nasaba reaksi ni promosikan ri GLS siagang GPT2 iami antu tanggung jawabna sintesis glutamat battu ri glutamin siagang transaminasi antara glutamat siagang α-ketoglutarat, upregulasi na ampa'nassai angkua neuron defisiensi OXPHOS nia' pa'minasanna glutamat, anne akkullei ni pattujuang untu' ampaentengi biosintesis proline (Gambara S5). Assilai siagang anne pa'pinraang, analisis proteomik astrosit serebelum battu ri tikus Mfn2cKO spesifik PN ampa'piitteangi angkua anne jalur-jalur (termasuk sikontu antiperoksidase) tena na'pinra signifikan ri ekspresi, jari ampa'piitteangi anne pengalihan metabolisme selektif mange ri PN yang terdegradasi (Gbr. S6, D to G).
Ri pa'pau singkamma, anne analisis napa'butti sanna' assisala-salana pola aktivasi temporal jalur metabolisme spesifik ri PN. Manna pole fungsi mitokondria neuronal abnormal akkullei ajari aterosklerosis riolo siagang remodeling 1C (Gambara 3E siagang Gambar S5C), siagang manna pole akkullei ni prediksi perubahan ekspresi kompleks I siagang IV, perubahan sintesis serin de novo iami antu bawang. OXPHOS disfungsi (Gambara 3E siagang Gambara S5C). Anne pa'paentengang a'nassai proses berurutan ri antere mitokondria (siklus 1C) siagang sitoplasma (biosintesis serin) ni picu ri stres sinergis siagang pa'naikanna aterosklerosis ri siklus TCA untu' a'bentu' ammotere' metabolisme neuronal.
8-minggu-umur OXPHOS-defisiensi PNs akkullei ampaentengi aktivitas eksitasi frekuensi tinggi siagang allaloi rekoneksi metabolisme signifikan untu' ampa'gannaki disfungsi mitokondria. Anne pa'paentengang ampa'nia' kasampatang menarik angkua manna ri kamma-kammaya anne, anne sel-sel akkulle tongi antarimai intervensi terapeutik untu' ampa'le'baki yareka anjagai neurodegenerasi. Terlambat. Ikatte ampa'le'baki anne kasampatang ilalang rua intervensi independen. Ri metode maka se're, ikatte a'rancang vektor virus terkait adeno (AAV) Cre-dependent sa'genna MFN2 akkullei ni ekspresikan secara selektif ri PNs kurang OXPHOS in vivo (Gambara S7A). AAV yang mengkodekan MFN2 dan gen reporter fluoresen mCherry (Mfn2-AAV) diverifikasi dalam kultur neuron primer in vitro, yang menyebabkan MFN2 untuk diekspresikan dalam cara Cre-dependent dan menyelamatkan morfologi mitokondria, sehingga mencegah neuromutasi di neuron Mfn2cKO (Gambar S7, D, D dan B). Nampa, nigaukangi paccoba in vivo untu' ampabattui Mfn2-AAV umuru 8 minggu secara stereotaktik mange ri korteks serebelum Mfn2cKO siagang tikus kontrol, siagang nianalisis tikus umuru 12 minggu (Gambara 4A). Tikus Mfn2cKO nirawat matei (Gambara 1, A siagang B) (16). Transduksi virus in vivo na wassele ekspresi selektif PN ri siapa are lingkaran serebelum (Gambara S7, G siagang H). Suntikan AAV kontrol yang mengekspresikan hanya mCherry (Ctrl-AAV) tidak memiliki efek signifikan pada tingkat neurodegenerasi pada hewan Mfn2cKO. Sikontutojenna, analisis Mfn2cKOs ni transduksi siagang Mfn2-AAV ampa'piitteangi efek perlindungan signifikan ri lapisang sel PN (Gambara 4, B siagang C). Khususna, kepadatan neuron sanna' tena nakkulle ni bedakan battu ri olo'-olo' kontrol (Gambara 4, B siagang C, siagang Gambara S7, H siagang I). Ekspresi MFN1 mingka teai MFN2 sanna'i baji'na ri pa'salama'na kamateang neuronal (Gambara 4C siagang Gambara' S7, C siagang F), nu'pa'piitteang angkua ekspresi MFN1 ektopik akkullei sanna' baji'na ampa'gannaki kakuranganna MFN2. Analisis lanjutang ri tingka PN tunggal ampa'piitteangi angkua Mfn2-AAV sanna'i na pasalamaki ultrastruktur mitokondria, na normalisasi tingka' mtDNA, siagang na balikkangi ekspresi tinggina penanda anti-angiogenesis PCx (Gambara 4, C mange ri E). Inspeksi visual tikus Mfn2cKO yang diselamatkan dalam keadaan istirahat menunjukkan bahwa postur dan gejala motoriknya (gerakan S1 hingga S3) meningkat. Kesimpulanna, anne paccoba-cobaya ampa'piitteangi angkua pa'pinraang ammotere'na MFN2 ri PNs sanna' kurangna ri OXPHOS sukku'mi untu' ampa'bali'i konsumsi mtDNA siagang ampa'jari aterosklerosis, sa'genna anre' na'kulle a'jari degenerasi akson siagang kamateang neuron in vivo.
(A) Skema nu ampa'piitteang jadwal eksperimental untuk ansuntikkan AAV ankode MFN2 punna jalur metabolisme nu nipa'piitteang ni aktifkan. (B) Gambar konfokal representatif irisan serebelum 12 minggu umuru ni transduksi ri 8 minggu ri tikus Mfn2cKO siagang ni label siagang antibodi anti-Calbindin. Kanang: Skala serat akson. Skala zoom akson iamintu 450 siagang 75 μm. (C) Kiri: Kuantifikasi kepadatan sel Purkinje ri loop transduksi AAV (AAV+) (analisis varians searah; n = 3 tikus). Kanang: analisis fokus mtDNA ri PN ni transduksi ri minggu 12 (uji t tenaya napasang; n = 6 sel battu ri tallu tikus). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Mikrograf elektron transmisi representatif PNs bageang serebelum Mfn2cKO ni transduksi siagang vektor virus yang ditunjukkan. Topeng merah jambua a'pa'piitteang tampa' nipantama ri dendrit, siagang kotak bertitik kuning a'pa'piitteang zoom nu nipasadia ri kanang; n a'wakilkan inti. Bar skala, 1μm. (E) ampa'piitteang conto pewarnaan PCx ri PN ni transduksi ri 12 minggu. Bar skala, 20μm. OE, overexpression; FC, lipat beru.
kalabbusanna, ikatte ansalidiki pentingna kelangsungan hidup sel yang diinduksi peroksidase ri PNs yang telah mengalami disfungsi OXPHOS. Ikatte ampa'jari mCherry ankode AAV-shRNA (RNA jepit rambut sike'de') khususna antargetkan mRNA PCx tikus (AAV-shPCx), siagang ansuntikkangi virus iareka kontrol scrambled (AAV-scr) mange ri serebelum tikus Mfn2cKO. Suntikan nigaukangi ri minggu maka appa umuru (Gambara 5A) untuk ampa'gannaki PCx knockdown efektif ri wattu ekspresi PCx nai' (Gambara 3C) siagang lapisan sel PN utuh ija (Gambara 1A). Parallui ni issengi angkua ancuruki PCx (Gambara S8A) a'kulle a'jari percepatan signifikan ri kamateang PN, yang ni batasi ri cincin infeksi (Gambara 5, B siagang C). Untu' ampahangi mekanisme efek metabolisme ni picu ri PCx up-regulation, nipelajari status redoks PNs ribokoangna PCx knockdown siagang AAV-mediated optical biosensor Grx1-roGFP2 ni ekspresikan secara bersamaan (Gambara S8, B sa'genna D) untu' angngukkuruki glutathione Perubahan relatif potensi redox peptida (383). Nampa, nigaukangi mikroskop pencitraan seumur hidup fluoresensi dua foton (FLIM) ri irisan otak akut Mfn2cKO umuru 7 minggu atau littermates kontrol untuk mendeteksi potensi perubahan status redoks sitoplasma setelah memverifikasi kondisi FLIM (Gambar S8, E hingga G). Analisisna ampa'piitteangi peningkatan signifikan ri keadaang oksidasi se're Mfn2cKO PNs kurang ekspresi PCx, yang berbeda dari neuron kontrol atau Mfn2cKO PNs yang mengekspresikan hanya shRNA scrambled (Gambar 5, D dan E). Ri wattu ekspresi PCx ni regulasi naung, persentase Mfn2cKO PNs ampa'piitteang keadaang tinggi oksidasi nai' labbi tallu kali (Gambara 5E), ampa'nassai angkua PCx up-regulasi ampaentengi kapasitas redoks neuron degeneratif.
(A) Skema nu ampa'piitteang jadwal eksperimental untuk ansuntikkan AAV ankode shPCx punna jalur metabolisme nu nipa'piitteang ni aktifkan. (B) Foto konfokal representatif bageang serebelum umuru 8 minggu ri tikus Mfn2cKO ni transduksi siagang ni label siagang antibodi anti-kalsineurin ri 4 minggu. Bar skala, 450μm. (C) Kuantifikasi kepadatan sel Purkinje ri AAV-transduksi loop (analisis varians searah; n = 3 sa'genna 4 tikus). Data ni pa'piitteang salaku rata-rata±SEM; ***P<0.001. (D) gambara FLIM representatif ampa'piitteang umuru rata-rata PN 7-minggu umuru'na ampa'nyatai sensor redoks glutation Grx1-roGFP2 ilalang kondisi eksperimental le'baka nipattantu. LUT (tabel pencarian) rasio: interval waktu kelangsungan hidup (ri pikodetik). Bar skala, 25μm. (E) Histogram ampa'piitteangi pa'bageang nilai umuru'na Grx1-roGFP2 battu ri (D) (n=158 sa'genna 368 sel ri rua tikus ri massing-massing kondisi). Bagan pie irate ri massing-massing histogram: ampa'piitteangi jaina sel siagang nilai umuru' la'bi la'bu (merah, teroksidasi) yareka la'bi sike'de' (biru, nikurangngi), ia la'bi 1 SD battu ri nilai umuru' rata-rata ri CTRL-AAV-scr. (F) Model yang diusulkan menunjukkan efek pelindung upregulasi PCx neuronal.
Sikontu-kontuna, data nu nipasadia anrinni ampa'piitteangi angkua ekspresi ulang MFN2 akkullei sukku' ampasalamaki PN lanjutang siagang defisiensi OXPHOS parah, depletion mtDNA parah, siagang morfologi sangkamma ista yang sanna' abnormalna, sa'genna akkullei assarei kemajuan tulusu' manna pole ri garring lanjutang. Neurodegenerasi assarei butti akkullea nipinra ri tahap riolo matena sel. Tingkat fleksibilitas metabolisme anne ni tekankan pole ri pakkullena neuron untu' angngerang aterosklerosis (rewiring siklus TCA), yang menghambat ekspresi PCx ri PN yang kurang OXPHOS dan meningkatkan kematian sel, sehingga berperan pelindung (Gambar 5F).
Ri anne pa'pilajaranga, kipa'sadiai butti angkua pa'pihaliang PNs mange ri disfungsi OXPHOS iamintu a'lette'-lette' mange ri aterosklerosis siklus TCA ilalang jalur aktivasi diferensial ni aktifkan ri program metabolisme. Ikatte ampa'nassai analisis proteomik siagang jai metode komplementer siagang ampa'nyatai punna ni tantang ri disfungsi mitokondria parah, neuron nia' bentu' elastisitas metabolisme yang tenayapa ni isse' riolo. Na lannasa ikatte, sikontu proses rewiring tena naparallu anjari tanra keadaang metabolisme terminal yang anrurungangi neurodegenerasi secara bertahap siagang tena nakkulle nipinra, mingka data ikatte ampa'nassai angkua akkullei a'jari neuron pemeliharaan bahkan ri tahap riolo kamateang sel Mekanisme kompensasi fungsional. Anne pa'pauanga ampa'nassai angkua neuron nia' tingka' plastisitas metabolisme ri batang kale. Anne faktaya a'butti angkua pa'paentengang poleang MFN2 ribokoangna akkullei napinra ekspresi penanda metabolisme kunci siagang anjagai degenerasi PN. Sikontutojenna, iami antu antahangi aterosklerosis siagang ampa gassingi saraf. transeksual.
Sala se're temuan yang paling menarik ri penelitianta iamintu PNs kurang OXPHOS akkullei napinra metabolisme siklus TCA siagang na atoroki enzim yang secara khusus merangsang arteriosklerosis. Penataan ulang metabolisme iami antu fitur umum sel kanker, siapa are battu ri anjo a'gandeng ri glutamin untu' ampa'gannaki perantara siklus TCA untu' appa'nia' setara reduksi, ia angngeranga rantai pernapasan siagang ampaentengi produksi prekursor biosintesis lipid siagang nukleotida (39 , 40). Se're penelitiang beru-berua ampa'piitteangi angkua ri jaringan perifer yang anrasai disfungsi OXPHOS, sambungan ulang metabolisme glutamin/glutamat iami antu fitur yang menonjol (5, 41), na arah antama'na glutamin ri siklus TCA ta'ganttung ri Nasaba' parahna cedera OXPHOS (41). ). Mingka, kurangi butti je'ne' ri sesena sangkamma plastisitas metabolisme neuronal ri batang kale siagang relevansina ri konteks garring. Ri se'reang studi in vitro beru-berua, neuron kortikal primer ni pa'piitteang akkullei a'mobilisasi kolam glutamat untuk neurotransmisi, sa'genna akkullei na promosikan metabolisme oksidatif siagang aterosklerosis ilalang kondisi stres metabolisme (42). Parallui ni issengi angkua ilalang inhibisi farmakologis enzim siklus TCA suksinat dehidrogenase, karboksilasi piruvat ni tappaki untu ampaentengi sintesis oksaloasetat ri neuron granul serebelum yang dikultur (34). Mingka, relevansi fisiologis mekanisme anne mange ri jaringan otak (ri kere-keremae aterosklerosis ni tappaki sanna' ni batasi ri astrosit) nia' ija signifikansi fisiologis pentingna (43). Ri anne passalaka, datata ampa'piitteangi angkua PNs ni rusak ri OXPHOS ri batang kalea akkullei nipinra mange ri degradasi BCAA siagang karboksilasi piruvat, iami antu ruaya sumber utama suplemen perantara kolam TCA. Manna pole kontribusi putatif katabolisme BCAA mange ri metabolisme energi neuronal lebba ni usulkan, pantaranganna peran glutamat siagang GABA untuk neurotransmisi (44), anre'pa na rie' butti untuk mekanisme in vivo. Jari, gampang ni spekulasikan angkua PN disfungsional akkullei otomatis a'balasa' konsumsi perantara TCA ni sorong ri proses asimilasi na natambai aterosklerosis. Khususna, upregulasi PCx akkullei niparalluangi untu ampaentengi permintaang asam aspartik, yang ni sarankan ri sel proliferasi siagang disfungsi mitokondria (45). Mingka, analisis metabolomik ikatte tena na ampa'piitteang beruang signifikan ri tingka' steady-state asam aspartat ri Mfn2cKO PNs (Gambara S6A), nu'kullea a'pa'piitteang pa'pakeang metabolisme asam aspartat nu'kullea a'pa'piitteang sel proliferasi siagang neuron pasca-mitosis. Manna pole mekanisme tepat upregulasi PCx ri neuron disfungsional in vivo anre'pa na'kulle ni tanra, ikatte ampa'piitteangi angkua anne tanggapang prematur a'kulle a'jari peran penting ri pa'jagaang keadaang redoks neuron, nu'pa'piitteang ri paccoba FLIM ri irisan serebelum. Khususna, anjagai PNs battu ri up-regulating PCx akkullei a'jari keadaang la'bi oksidasi siagang ampa'jari pila' gassing kamateang sel. Aktivasi degradasi BCAA siagang karboksilasi piruvat teai cara untu' ampa'nassai jaringan tepi disfungsi mitokondria (7). Jari, iami antu fitur prioritas neuron OXPHOS-defisiensi, manna pole teai fitur se'reji, yang penting untuk neurodegenerasi. .
Panyakit serebelum iami antu jenis panyakit neurodegeneratif heterogen yang biasana ni pa'piitteang salaku ataxia siagang biasana ancuruki PNs (46). Populasi neuron anne sanna' rentanna ri disfungsi mitokondria nasaba' degenerasi selektifna ri tikus sukku' untu' ampa'jari jai gejala motorik nu'kullea a'jari tanra ataksia spinocerebellar rupataua (16, 47, 48). Situru laporang, modele tikus transgenik siagang gen mutan ni pasisambungangi siagang ataksia spinocerebellar rupataua siagang nia disfungsi mitokondria (49, 50), na paentengi pentingna amparessai konsekuensi defisiensi OXPHOS ri PNPH. Jari, sanna' cocokna untu' a'isolasi siagang amparessai anne populasi neuron unika. Mingka, nasaba PNs sanna' sensitifna ri tekanan siagang a'jari proporsi rannu ri sikontu populasi sel serebelum, untuk jai studi berbasis omics, pemisahan selektif battu ri ke'nanga salaku sel sukku' iami antu aspek tantangan. Manna mamo sanna' tena nakkulle nigappa kontaminasi mutlak ri rupanna sel maraenga (terutama jaringan tau toa), mingka nipa'se'rei langkah dissosiasi efektif siagang FACS untu' anggappa jumlah neuron yang sukku' untu' analisis proteomik hilir, siagang nia' cakupan protein tinggi (kira-kira 3000 protein) punna nipasibandingi siagang data serebelum niaka (515). Nasaba' ampa'jagai kelangsungan hidupna sel-sel sukku', cara ni pa'sadia anrinni anre'ja na'kulle amparessai pa'pinraang jalur metabolisme ri mitokondria, mingka akkulle tongi amparessai pa'pinraang ri rekan-rekan sitoplasma, nu'kullea ampa'gannaki pa'pakeang tag membran mitokondria untu' ampa'gannaki tipe sel Cara beru untu' nomoro' mitokondria ri jaringan kompleks (255, 25). Metode yang kami jelaskan tidak hanya terkait dengan studi sel Purkinje, tetapi dapat dengan mudah diterapkan dengan setiap jenis sel untuk mengatasi perubahan metabolisme di otak yang sakit, termasuk model disfungsi mitokondria lainnya.
Paccappurenna, nia'mo niidentifikasi jendela terapeutik ilalang proses susunan ulang metabolisme anne akkullea ampa'le'baki tanra-tanra kunci stres seluler siagang anjagai degenerasi neuronal. Jari, ampahangi implikasi fungsional rewiring ni carita anrinni akkullei assarei wawasan mendasar ri sesena perawatan yang mungkin untuk ampaentengi kelangsungan hidup neuronal selama disfungsi mitokondria. Penelitian masa depan yang bertujuan untuk membedah perubahan metabolisme energi pada jenis sel otak lainnya diperlukan untuk sepenuhnya mengungkapkan penerapan prinsip ini untuk penyakit saraf lainnya.
Tikus MitoPark lebba ni carita riolo (31). Tikus C57BL/6N siagang loxP a'dalle' ri gen Mfn2 le'ba'mi ni carita riolo (18) siagang ni silang siagang tikus L7-Cre (23). Keturunan heterozigot ganda yang dihasilkan kemudian disilangkan dengan tikus homozigot Mfn2loxP/Mfn2loxP untuk menghasilkan knockout gen spesifik Purkinje untuk Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Ri se'reang subset pa'buntingang, Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP allele (stop-mtYFP) nipantamaki lalang persimpangan tambahan (20). Sikontu prosedur olo'-olo' nigaukangi situru' pandudu'na Eropa, nasional siagang lembaga siagang nisare kasampangang ri LandesamtfürNatur battu ri Umwelt siagang Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Jerman. Pajama olo'-olo' to'ji anturuki bimbingang battu ri Federasi Eropa Asosiasi Ilmu Olo'-olo' Laboratorium.
Punna lebaki ni bius dislokasi serviks baine ammana, embrio tikus ni isolasi (E13). Korteks ni bedah ri Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) nitambai siagang 10 mM Hepes siagang nipassareang ri Dulbecco's Modified Eagle's Medium niaka papain (20 U/ml) siagang sistein (1μg/ml). Inkubasi jaringan ri DMEM) siagang dissosiasikanngi siagang pencernaan enzimatik. Ml) ri 37°C 20 menit, nampa ni giling secara mekanis ri DMEM nitambai siagang 10% serum sapi janin. Sel-sel ni tanam ri kaca coverslips ni lapisi siagang polilisin ri kepadatan 2×106 per piring kultur 6 cm atau ri kepadatan 0,5×105 sel/cm2 untuk analisis pencitraan. Punna lebaki 4 jam, media ni ganti siagang media bebas serum Neurobasal niaka 1% suplemen B27 siagang 0,5 mM GlutaMax. Neuron-neuron nampa nijaga ri 37°C siagang 5% CO2 lalang sikontu paccoba, siagang nisare kanre sikali sibulang. Untu' ampa'jari rekombinasi in vitro, 3μl (piring kultur 24-sumur) atau 0,5μl (piring 24-sumur) vektor virus AAV9 berikut ini digunakan untuk mengobati neuron pada hari kedua in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, nomoro katalog 105530-AAV9) siagang AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, nomoro katalog 105545-AAV9).
Tikus Mfn1 siagang Mfn2 komplementer DNA (nigappai battu ri Addgene plasmid #23212 siagang #23213, massing-massing) ni tanrai siagang urutan V5 (GKPIPNPLLGLDST) ri C-terminus, siagang ni campur siagang mCherry ri bingkai lalang urutan T2A. Grx1-roGFP2 iami antu hadia battu ri Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). siagang a'letteki kaset tdTomato ammake cara kloning konvensional, kaset ni subkloning mange ri pAAV-CAG-FLEX-tdTomato tulang riboko (nomor referensi Addgene 28306) untuk ampa'jari pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-G FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 siagang pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 vektor. Strategi yang sama digunakan untuk menghasilkan vektor kontrol pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Untu ampa'jari konstruksi AAV-shPCx, vektor AAV plasmid (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) niparalluangi, ia niaka urutan DNA ankode shRNA na targetkan tikus PCx (5′CTTTCGCTAGCTAGGCTAAGGCTAAGGCTAGACTTAGACTTAGA 3′) Ri yawa kendali promotor U6, mCherry ni pakei ilalang kendali promotor CMV. Produksi vektor AAV bantu nigaukangi situru instruksi pabrik (Cell Biolabs). Singkatanna, pakei plasmid transfer angngerang mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) transien Transfeksi sel 29A-MFN2-V5-AV5-AV5 mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) atau Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) gen pengkodean, serta pengkodean protein kapsid AAV1 dan protein aksesori Plasmid plasmid pengemasan, menggunakan metode kalsium fosfat. Supernatan virus kasar niallei battu ri siklus beku-cair ri es kering/etanol siagang sel ni lisi ri saline penyangga fosfat (PBS). Vektor AAV ni murnikan siagang ultrasentrifugasi gradien iodixanol diskontinu (24 jam ri 32.000 rpm siagang 4°C) siagang ni konsentrasikan ammake filter sentrifugal ultra-15 Amicon. Titer genom AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 genome copy (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX sangkamma lebba ni carita riolo (4q-dd PCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) siagang AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml).
Neuron primer ni kerok ri 1x PBS dinging es, ni pelet, nampa ni homogenkan ri 0,5% Triton X-100 / 0,5% sodium deoxycholate/PBS lysis buffer niaka fosfatase siagang protease inhibitor (Roche). Kuantifikasi protein nigaukangi siagang ammake assay asam bicinchoninic (Thermo Fisher Scientific). Protein-protein nampa nipisangkai siagang elektroforesis gel SDS-poliakrilamida, nampa ni blot mange ri membran poliviniliden fluorida (GE Healthcare). Blokir situs non-spesifik siagang inkubasi siagang antibodi primer (ciniki Tabel S1 untuk rincianna) ri 5% susu ri TBST (Tris-buffered saline siagang Tween), langkah-langkah cuci siagang antibodi sekunder ri TBST Inkubasi. Inkubasi siagang antibodi primer sibulang ri +4°C. Punna lebaki ni cuci, pakei antibodi sekunder 2 jam ri suhu kamara. Nampa, siagang inkubasi blot yang sama siagang antibodi anti-β-aktin, pemuatan yang sama ni konfirmasi. Deteksi siagang a'pinra a'jari chemiluminescence siagang a'paenteng chemiluminescence (GE Healthcare).
Neuron yang sebelumnya ditanam pada penutup kaca diperbaiki dengan 4% paraformaldehida (PFA)/PBS pada titik waktu yang ditentukan pada suhu kamar selama 10 menit. Coverslips uru-uruna ni permeasi siagang 0,1% Triton X-100/PBS 5 menit ri suhu kamara, nampa ri penyangga penghalang [3% albumin serum sapi (BSA)/PBS]. Ri allo maka rua, coverslips ni cuci siagang penyangga penghalang siagang ni inkubasi siagang antibodi sekunder konjugasi fluorophore yang cocok selama 2 jam ri suhu kamara; kala’busanna, sampel ni cuci baji’-baji’ ri PBS siagang 4′,6-diamidino-2 -Phenylindole (DAPI) ni counterstain nampa ni pasang ri slide mikroskop siagang Aqua-Poly/Mount.
Tikus (laki-laki siagang baine) ni bius siagang suntikan intraperitoneal ketamin (130 mg/kg) siagang xylazine (10 mg/kg) siagang nisare secara subkutan siagang carprofen analgesic (5 mg/kg), siagang nipadongko ri instrumen stereotaktik (Kopf) ni pasadiai siagang warm. Pa'piitteang ulunna siagang pakei bor gigi untu' ampa'piitteangi bageang korteks serebelum nu sicocoka siagang tulang mis (battu ri lambda: ekor 1.8, lateral 1, sicocoka siagang lobus IV siagang V). Pakei jarum suntik melengkung untuk ampa'jari baji'-baji' kali'bong ca'di ri ulunna sollanna tena na'ganggu pembuluh darah ri rawanganna. Nampa kapiler kaca tipis ni gambara nipantama lambat-lambat ri micro-hole (battu ri -1,3 sanggenna -1 ri sisi ventral dura mater), siagang 200 sanggenna 300 nl AAV ni suntik ri mikro-injector (Narishige) siagang jarum suntik manual (Narishige) pirangalloang ri tekanang rannu lalang wattu 10 menit sanggenna 20 menit. Punna lebaki infus, padongkoki kapiler 10 menit pole sollanna akkulle virus a'la'bang sukku'. Punna lebaki niangkak kapiler, anjo kulia nijait bajiki sollanna akkullei nikurangngi radangna lokoka siagang akkullei anjo olo'-oloka a'jari baji'. Anjo olo'-oloka nirawatang siagang analgesik (caspofen) pirangalloang ribokoangna operasi, ilalang wattu anjo kondisi fisikna nipantamaki baji'-baji' nampa ni eutanasia ri wattu le'baka nipau. Sikontu prosedur nigaukangi situru pandudu eropa, nasional siagang lembaga siagang ni setujui ri LandesamtfürNatur battu ri Umwelt siagang Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Jerman.
Anjo olo'-oloka ni bius siagang ketamin (100 mg/kg) siagang xylazine (10 mg/kg), nampa atinna ni perfusi siagang 0,1 M PBS riolo, nampa 4% PFA ri PBS. Jaringanna ni bedah siagang ni paenteng ri 4% PFA/PBS sibulang ri 4°C. Pisau bergetar (Leica Microsystems GmbH, Wina, Austria) ni pakei untu appasadia bageang sagital (tebal 50 μm) battu ri otak tette ri PBS. Kecuali punna rie' pa'pau maraeng, pewarnaan bageang-bageang a'layang bebas nigaukangi sangkamma ni carita ri dallekang (13) ri suhu kamara siagang ni aduk. Singkatna, uru-uruna, irisan ni gappa ni permeabilisasi siagang 0,5% Triton X-100/PBS 15 menit ri suhu kamara; untuk siapa are epitope (Pcx siagang Shmt2), siagang ri penyangga tris-EDTA ri 80°C (PH 9) pa'panaiki irisan 25 menit teai anne langkah. Nampa, anjo bageang-bageanga ni inkubasi siagang antibodi primer (ciniki Tabel S1) ri penyangga penghalang (3% BSA/PBS) ri 4°C sibulang siagang ni aduk. Ammukona, anjo bageang-bageanga ni cuci siagang penyangga penghalang siagang ni inkubasi siagang antibodi sekunder konjugasi fluorofor yang cocok selama 2 jam ri suhu kamara; kala’busanna, anjo bageang-bageanga nije’ne’ baji’-baji’ ri PBS, niwarnai siagang DAPI, nampa nipaenteng siagang AquaPolymount Ri se’reang slide mikroskop.
Mikroskop konfokal pemindaian laser (TCS SP8-X atau TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) yang dilengkapi dengan laser cahaya putih dan laser ultraviolet 405 dioda digunakan untuk menggambarkan sampel. Nasaba' a'pa'se'rei fluorophore siagang a'pa'se're sinyal siagang Hybrid Detector (HyDs), LAS-X software nipake untu' a'pa'se're gambara' a'tumpu' situru' sampling Nyquist ri mode berurutan: untuk panel non-kuantitatif, iami antu sinyal tinggi dinamis (ebara'na, ri sel somatik siagang dendrit) mty FPD untu' a'deteksi Hybrid nomor BPNR mode). Gating battu ri 0.3 sanggenna 6 ns nipake untu' ampa'kurangi latar belakang.
Pencitraan real-time sel yang diurutkan. Punna lebaki ni urusi ri media Neurobasal-A niaka 1% B27 suplemen siagang 0,5 mM GlutaMax, sel-sel langsung ni tanam ri kaca berlapis poli-l-lisin (μ-Slide8 Nah, Ibidi, nomor katalog 80826), nampa nijagai ri 37°C siagang 12% untu' sel untu' ampa'biangngi sel ammantang. Pencitraan real-time nigaukangi ri mikroskop konfokal pindai laser Leica SP8 ni pasangkammai siagang laser pute, HyD, 63×[1.4 bukaan numerik (NA)] lensa objektif minyak siagang tahap pemanasan.
Tikus ni bius sanna' linta'na siagang karbon dioksida siagang ni potong ulunna, otakna sanna' linta'na nipasulu' battu ri ulunna, siagang nikanre 200 μm tebalna (untu' eksperimen pelabelan 13C) iareka 275 μm tebalna (untu' rua eksperimen foton) bageang sagital niisi siagang bahan-bahan berikut Es krim (HM-505, Themorific, Themorific, Scientific Walldorf, Jerman) niisi siagang zat-zat kamma anne: 125 mM dinging es, jenuh karbon (95% O2 siagang 5% CO2) Ca2 rannu + cairan serebrospinal buatan (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM penyangga natrium fosfat, NaCl, 2,5 mM, mM, 0.5 mM CaCl2 siagang 3.5 mM MgCl2 (tekanan osmotik 310 sanggenna 330 mmol). Pindahkan irisan otak yang diperoleh ke ruang pra-inkubasi yang mengandung Ca2 + ACSF tinggi (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM penyangga natrium fosfat, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukosa, 10 mM dan 20 mM Ca. MgCl2) Medium) pH 7.4 siagang 310 sanggenna 320 mmol).
Ri wattu proses pencitraan, irisan-irisan nipalette mange ri kamara pencitraan khusus, siagang percobaan nigaukangi ilalang perfusi ACSF tulusu ri suhu konstan 32° sanggenna 33°C. Mikroskop pemindaian laser multifoton (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) ni pasadia siagang lensa objektif Leica 25x (NA 0,95, je'ne'), Ti: Sapphire laser (Chameleon Vision II, Coherent) ni pakei untuk pencitraan irisan. Modul FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM battu ri Grx1-roGFP2. Pa'pinraang ri keadaang redoks sitoplasma PNs ni ukkuru' siagang rua-foton FLIM ri irisan otak sagittal, na biosensor Grx1-roGFP2 na targetkan PNs. Ri lapisi PN, bidang akuisisi nipile kira-kira 50 sanggenna 80 μm irawanganna permukaan irisan untuk memastikan bahwa ada PN yang layak (iamintu, kurangnya struktur manik-manik atau perubahan morfologis neuronal di sepanjang dendrit) dan sensor roGFP2 positif ganda dan AAV yang mengkode shRNA PCx atau urutan kontrolnya (masing-masing mengekspresi mCherry). Pa'rappungang gambara tumpukan siagang 2x zoom digital [panjang gelombang eksitasi: 890 nm; 512 nm 512 piksel]. Deteksi: HyD internal, fluorescein isothiocyanate (FITC) filter group] siagang gambara rata-rata lalang 2 sa'genna 3 menit nipake untu' ampa'nassai angkanaya sukku'mi foton ni pa'rappungang (1000 foton kabusu'na) untu' pas kurva. Sensitivitas probe Grx1-roGFP2 siagang verifikasi kondisi FLIM nigaukangi siagang amparessai nilai umur roGFP2 ri wattu nitambai 10 mM H2O2 eksogen mange ri ACSF perfusi (untu' ampa'la'bangi oksidasi, na'jari pila' lompo umuru'na), nampa nitambai 2 mM dithiothreit (nampa kurangi derajat reduksi panra'na umuru) (Gambara S8, D mange ri G). Pakei perangkat lunak FLIMfit 5.1.1 untuk analisis hasil yang diperoleh, paskan kurva peluruhan eksponensial tunggal dari seluruh gambara ke IRF yang diukur (fungsi tanggapan instrumen), dan χ2 kira-kira 1. Untuk menghitung umur satu PN, masker di sekitar tubuh saraf digambar secara manual dan kuantifikasi umur untuk setiap mask digunakan.
Analisis potensi mitokondria. Punna lebaki bageang akut ni inkubasi siagang 100 nM TMRM langsung ni tambai mange ri ACSF ni perfusi 30 menit, perubahan potensial mitokondria PNs ni ukkuru siagang mikroskop dua foton. Pencitraan TMRM nigaukangi siagang ampa'gio'i probe ri 920 nm siagang ammake HyD internal (tetrametilrodamin isotiosianat: 585/40 nm) untu' angngalle sinyal; siagang ammake gelombang eksitasi yang sama mingka ammake HyD internal yang berbeda (FITC :525/50) untuk menggambarkan mtYFP. Pakei ImageJ's Image Calculator plug-in untuk ansalidiki potensi mitokondria ri tingka sel tunggal. Singkatna, persamaan plug-in: sinyal = min (mtYFP, TMRM) ni pakei untuk angngassengi daerah mitokondria nu ampa'piitteang sinyal TMRM ri Purkinje Somali ri gambara konfokal tumpukan tunggal saluran yang sesuai. Nampa area piksel ri masker nu ni gappa ni ukkuru, nampa ni normalisasi ri gambara tumpukan tunggal ambang batas yang sesuai ri saluran mtYFP untuk anggappa fraksi mitokondria nu ampa'piitteang potensi mitokondria.
Anjo gambara ni dekonvolusi siagang perangkat lunak Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Untuk gambara ubin yang dipindai, montase ubin tunggal dibuat menggunakan algoritma jahitan otomatis yang disediakan oleh perangkat lunak LAS-X. Punna lebaki kalibrasi gambara, pakei ImageJ siagang Adobe Photoshop untu' ampa'la'bangi gambara siagang ampa'se'rei sanna'na siagang kontrasna. Pakei adobe illustrator untuk appasadia grafik.
analisis fokus mtDNA. Jaina lesi mtDNA ni ukkuru ri bageang serebelum ni label siagang antibodi mange ri DNA siagang mikroskop konfokal. massing-massing area target ni paentengi untuk batang kale sel siagang inti massing-massing sel, siagang area massing-massing nirekengi ammake plug-in Multi Measure (perangkat lunak ImageJ). Kurangi area inti battu ri area tubuh sel untuk anggappa area sitoplasma. Paccappurenna, plug-in Analyze Particles (perangkat lunak ImageJ) nipakei untu' angngukkuruki secara otomatis titik DNA sitoplasma nu'pa'piitteang mtDNA ri gambara ambang, siagang wassele' nu'kullea ni normalisasi mange ri rata-rata PN tikus CTRL. Hasilna nipa'piitteang salaku nomoro rata-rata nukleosida per sel.
Analisis ekspresi protein. Pakei ImageJ's Image Calculator plug-in untuk ansalidiki ekspresi protein ri PN ri tingka sel tunggal. Singkatna, ri gambara konfokal lapisang tunggal saluran yang sesuai, melalui persamaan: sinyal = min (mtYFP, antibodi), daerah mitokondria yang menunjukkan imunoreaktivitas terhadap antibodi tertentu di Purkina diidentifikasi. Nampa area piksel ri masker nu ni gappa ni ukkuru, nampa ni normalisasi ri gambara tumpukan tunggal ambang batas yang sesuai ri saluran mtYFP untuk anggappa fraksi mitokondria protein ni pa'piitteang.
Analisis kepadatan sel Purkinje. Plug-in Cell Counter battu ri ImageJ nipakei untu' ansalidiki kepadatan Purkinje siagang nibage-bagei jaina sel Purkinje nirekeng siagang la'buna cincin serebelum nipantama ri sel nirekeng.
Persiapan siagang pa'rappungang sampel. Otak battu ri kelompok kontrol siagang tikus Mfn2cKO nipasangi ri 2% PFA/2,5% glutaraldehida ri 0,1 M penyangga fosfat (PB), nampa bageang koronal nipasadiai ammake silia (Leica Mikrosysteme GmbH, Wina, Austria) (Ketebalan 50 sa'genna 60 μm) Penyangga ri 1% PB tetraoksida siagang 1,5% kalium ferrosianida ri suhu kamara 1 jam. Bageang-bageang ni cuci tallu pissang siagang je'ne' suling, nampa niwarnai siagang 70% etanol niaka 1% uranil asetat 20 menit. Bageang-bageanga nampa ni dehidrasi ri alkohol bertingkat siagang nipantama ri Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoxy resin (Electron Microscopy Sciences, nomor katalog 14040) ri alla kaca berlapis silikon, siagang kala’busanna ri 60°C ni polimerisasi ri oven 48 jam. Area korteks serebelum nipile siagang 50 nm bageang ultrathin ni potong ri Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Wina, Austria) siagang ni pile ri kisi celah tembaga 2×1 mm ni lapisi siagang film polistirena. Bageang-bageang niwarnai siagang larutan 4% uranil asetat ri H2O 10 menit, ni cuci siagang H2O pirangalloang, nampa siagang sitrat timah Reynolds ri H2O 10 menit, nampa ni cuci siagang H2O pirangalloang. Mikrograf niallei siagang mikroskop elektron transmisi Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ammake TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 kamera digital (TVIPS GmbH, Gauting, USA). Jerman).
Untuk tikus yang terinfeksi AAV, otaknya dipisah dan dipotong menjadi bagian sagital tebal 1 mm, dan serebelum diperiksa menggunakan mikroskop fluoresensi untuk mengidentifikasi cincin yang terinfeksi AAV (iamintu, mCherry mengekspresikan). Eksperimenji bawang ri kere-keremae injeksi AAV a'jari efisiensi transduksi tinggi ri lapisi' sel Purkinje (iamintu sanna' tinggina lapisi'na) ri kaminang kurangna rua cincin serebelum berturut-turut nipake. Loop yang ditransduksi AAV dimikrodiseksi untuk pasca-fiksasi semalam (4% PFA dan 2,5% glutaraldehida dalam 0,1 M penyangga kakao) dan diproses selanjutnya. Untuk EPON embedding, jaringan tetap dicuci dengan 0,1 M penyangga kakao natrium (Applichem), dan diinkubasi dengan 2% OsO4 (os, Layanan Sains; Caco) dalam 0,1 M penyangga kakao natrium (Applichem) 4 Jam, kemudian dicuci selama 2 jam. Ulangi 3 pissang siagang 0,1 M penyangga kokamida. Nampa, seri nai'na etanol nipake untu' inkubasi massing-massing larutan etanol ri 4°C 15 menit untu' ampa'jari dehidrasi jaringan. Jaringanna nipalette mange ri propylene oxide siagang ni inkubasi bangngi ri EPON (Sigma-Aldrich) ri 4°C. Padongkoki tisu ri EPON beru ri suhu kamara 2 jam, nampa nu padongko ri 62°C 72 jam. Pakei ultramicrotome (Leica Microsystems, UC6) siagang piso berlian (Diatome, Biel, Swiss) untu' anreppeki bageang ultratipis 70 nm, siagang nodai siagang 1,5% uranil asetat 15 menit ri 37°C, siagang nodai siagang larutan timah sitrat 4 menit. Mikrograf elektron niallei ammake mikroskop elektron transmisi JEM-2100 Plus (JEOL) ni pasadia siagang Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) siagang perangkat lunak DigitalMicrograph (Gatan). Untuk analisis, mikrograf elektron niallei siagang 5000× atau 10.000× zoom digital.
Analisis morfologis mitokondria. Untuk sikontu analisis, kontur mitokondria individu ni garisi manual ri gambara digital ammake perangkat lunak ImageJ. Parameter morfologis yang berbeda dianalisis. Kepadatan mitokondria ni pa'piitteang salaku persentase ni gappa punna ni bagi total luas mitokondria massing-massing sel siagang luas sitoplasma (luas sitoplasma = luas sel-luas inti sel) × 100. Kebulatan mitokondria ni hitung siagang rumus [4π∙(luas/perimeter 2)]. Morfologi ista mitokondria ni analisis siagang ni bage rua kategori ("tubular" siagang "blister") situru bentu poko'na.
Analisis nomor siagang kepadatan autofagosom/lisosom. Pakei perangkat lunak ImageJ untuk manual garisi kontur massing-massing autofagosom/lisosom ri gambara digital. Luas autofagosom/lisosom nipa'piitteang salaku persentase nirekeng siagang nibage total luas struktur autofagosom/lisosom massing-massing sel siagang luas sitoplasma (luas sitoplasma=luas sel-luas inti)×100. Kepadatan autofagosom/lisosom nirekengi siagang nibage jaina siagang jaina struktur autofagosom/lisosom per sel (ri sesena luas sitoplasma) (luas sitoplasma = luas sel-luas inti).
Labeling untuk sectioning akut siagang persiapan sampel. Untuk eksperimen yang membutuhkan pelabelan glukosa, transferkan irisan otak akut ke ruang pra-inkubasi, yang mengandung karbon jenuh (95% O2 dan 5% CO2), tinggi Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM penyangga natrium fosfat, 2,5 mM NaCl, 2,5 mM. d-glukosa, 1,0 mM CaCl 2 siagang 2,0 mM MgCl 2, nipantama ri pH 7,4 siagang 310 sa'genna 320 mOsm), ri glukosa iamintu 13 C 6- substitusi glukosa (Eurisotop, nomor katalog CLM-1396). Untuk eksperimen yang membutuhkan pelabelan piruvat, transferkan irisan otak akut ke Ca2 + ACSF yang lebih tinggi (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM penyangga natrium fosfat, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukosa, 10,0 mM Ca, 20 MM dan Ad. MgCl2, atoroki pH 7.4 siagang 310 mange ri 320mOsm), siagang tambai 1mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop, nomor katalog CLM-1082). Inkubasi bageang-bageang 90 menit ri 37°C. Ri paccappurenna paccoba, bageang-bageanga ni cuci sanna' linta'na siagang larutan berair (pH 7,4) niaka 75 mM amonium karbonat, nampa ni homogenkan ri 40:40:20 (v:v:v) asetonitril (ACN): metanol: je'ne'. Punna lebaki anjo bageang-bageang ni inkubasi ri es 30 menit, sampel ni sentrifugasi ri 21.000 g 10 menit ri 4°C, siagang supernatan bening ni keringkan ri konsentrator SpeedVac. Pelet metabolit kering yang dihasilkan disimpan pada -80°C hingga dianalisis.
Analisis kromatografi cair-spektrometri massa 13 asam amino berlabel C. Untuk analisis kromatografi cair-spektrometri massa (LC-MS), pelet metabolit disuspensi ulang dalam 75μl air kelas LC-MS (Honeywell). Punna lebaki ni sentrifugasi ri 21.000 g 5 menit ri 4°C, 20 μl supernatan ni klarifikasi nipakei untuk analisis fluks asam amino, nampa sisa ekstrak ni pake langsungi untuk analisis anion (ciniki ri yawa). Analisis asam amino nigaukangi siagang protokol derivatisasi benzoil klorida lebba ni carita riolo (55, 56). Ri langkah maka se're, 10μl 100 mM natrium karbonat (Sigma-Aldrich) nitambai mange ri 20μl ekstrak metabolit, nampa 10μl 2% benzoyl chloride (Sigma-Aldrich) nitambai mange ri LC grade ACN. Sampel ni vortex sike'de' nampa ni sentrifugasi ri 21.000 g 5 menit ri 20°C. Paletteki supernatan yang lebba nitangkasi mange ri botol autosampler 2 ml siagang sisipan kaca kerucut (volume 200 μl). Sampel ni analisisi ammake Acquity iClass ultra-high performance LC system (Waters) ni sambungkan mange ri Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) spektrometer massa presisi tinggi resolusi (Thermo Fisher Scientific). Untuk analisis, 2μl sampel turunan disuntikkan ke dalam kolom T3 silika tinggi kekuatan 100×1,0 mm yang mengandung 1,8μm partikel. Laju aliranna 100μl/min, siagang sistem penyangga niaki ri penyangga A (10 mM amonium format siagang 0,15% asam formik ri laleng je'ne') siagang penyangga B (ACN). Gradienna iamintu: 0%B ri 0 menit; 0%B. 0 sa'genna 15% B ri 0 sa'genna 0,1 menit; 15 sa'genna 17% B ri 0,1 sa'genna 0,5 menit; B ri 17 sa'genna 55% ri 0,5 sa'genna 14 menit; B ri 55 sanggenna 70% ri 14 sanggenna 14,5 menit; ri 14.5 mange ri 70 mange ri 100% B ri 18 menit; 100% B ri 18 sanggenna 19 menit; 100 sa'genna 0% B ri 19 sa'genna 19,1 menit; 0% B ri 19.1 sanggenna 28 menit (55, 56). Spektrometer massa QE-HF a'operasi ri mode ionisasi positif siagang rentang massa m/z (rasio massa/muatan) 50 sanggenna 750. Resolusi yang diterapkan adalah 60.000, dan target ion kontrol gain (AGC) yang diperoleh adalah 3×106, dan waktu ion maksimum adalah 10 milikon. Sumber ionisasi elektrospray (ESI) yang dipanaskan beroperasi pada tegangan semprotan 3,5 kV, suhu kapiler 250°C, aliran udara sarung 60 AU (unit sewenang-wenang), dan aliran udara bantu 20 AU. 250°C. Lensa S nipasangi ri 60 AU.
Analisis kromatografi anion-MS asam organik berlabel 13C. Sisa endapan metabolit (55μl) ni analisisi ammake sistem kromatografi ion Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) ni sambungkan mange ri spektrometer massa QE-HF (Thermo Fisher Scientific). Singkatna, 5μl ekstrak metabolit ni suntikkangi ri kolom Dionex IonPac AS11-HC ni pasangkammai siagang HPLC (2 mm×250 mm, ukurang partikel 4μm, Thermo Fisher Scientific) ri mode loop parsial push-in siagang rasio pengisian 1. ) Dionex IonPac AG11-HC kolom ( x 250 mm, kolom HC 4μm, Thermo Fisher Scientific). Suhu kolom ni paentengi ri 30°C, siagang autosampler ni pasang ri 6°C. Pakei kartrid kalium hidroksida nipasadia siagang je'ne' deionisasi untu' ampa'jari gradien kalium hidroksida ilalang generator eluen. Pa'bageang metabolit ri laju aliran 380μl/min, ammake gradien kamma anne: 0 sanggenna 3 menit, 10 mM KOH; 3 sa'genna 12 menit, 10 sa'genna 50 mM KOH; 12 sanggenna 19 menit, 50 sanggenna 100 mM KOH; 19 sa'genna 21 menit, 100 mM KOH; 21 sa'genna 21,5 menit, 100 sa'genna 10 mM KOH. Kolom ni seimbangkan poleang irawanganna 10 mM KOH 8,5 menit.
Metabolit yang dieluasi digabungkan dengan aliran suplemen isopropanol 150μl/min setelah kolom dan kemudian diarahkan ke spektrometer massa resolusi tinggi yang beroperasi dalam mode ionisasi negatif. MS anjagai rentang massa battu ri m/z 50 sanggenna 750 siagang resolusi 60.000. AGC nipasangi 1×106, siagang wattu ion maksimal nijagai ri 100 ms. Sumber ESI yang dipanaskan dioperasikan pada tegangan semprot 3,5 kV. Pangngatoroang maraeng battu ri sumber ion iamintu: suhu kapiler 275°C; aliran gas sarung, 60 AU; aliran gas bantu, 20 AU ri 300°C, siagang lensa S ni 60 AU.
Analisis data 13C berlabel metabolit. Pakei perangkat lunak TraceFinder (versi 4.2, Thermo Fisher Scientific) untuk analisis data rasio isotop. Identitas massing-massing senyawa ni verifikasi ri senyawa referensi yang andal siagang ni analisis secara independen. Untu anggaukangi analisis pengayaan isotop, area kromatogram ion yang diekstraksi (XIC) setiap isotop 13C (Mn) diekstraksi dari [M + H] +, di mana n adalah nomor karbon senyawa target, digunakan untuk menganalisis asam amino atau [ MH] + digunakan untuk menganalisis anion. Akurasi massa XIC kurang battu ri lima bageang per juta, siagang akurasi RT iamintu 0,05 menit. Analisis pengayaan nigaukangi siagang anghitung rasio massing-massing isotop nideteksi mange ri pa'rappungang isotop senyawa yang sesuai. Rasio-rasio anne nisareangi salaku nilai persentase untu' massing-massing isotop, siagang wassele'na nipa'nyatai salaku persentase pengayaan molar (MPE), sangkamma le'baka nipau riolo (42).
Pelet neuron beku ni homogenkan ri es dinging 80% metanol (v/v), ni vortex, siagang ni inkubasi ri -20°C 30 menit. Vortex sampel pole siagang aduk ri +4°C 30 menit. Sampel ni sentrifugasi ri 21.000 g 5 menit ri 4°C, nampa supernatan nu ni pa'rappungang siagang ni keringkan ammake konsentrator SpeedVac ri 25°C untuk analisis ribokoangna. Sangkamma ni carita ri dallekang, analisis LC-MS nigaukangi ri asam amino sel ni urusi. Pake TraceFinder (versi 4.2, Thermo Fisher Scientific), analisis data nigaukangi ammake massa monoisotopik massing-massing senyawa. Normalisasi kuantil data metabolit nigaukangi ammake paket perangkat lunak preprocessCore (57).
Persiapan irisan. Tikus ni bius sanna' linta'na siagang karbon dioksida nampa ni potong ulunna, otakna sanna' linta'na nipasulu' battu ri ulunna, siagang piso getar niisi' es (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Jerman) nipake untu' anreppeki a'jari 300 sa'genna 375 μm bageang sagital karbon dioksida siagang gas dingin (25% CO) Ca2 + ACSF rannu (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM penyangga fosfat natrium, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukosa, 1.0 mM CaCl2 siagang 6.0 mM MgCl2 Atoroki mange ri pH 4 siagang 303 mO). Pindahkan irisan otak yang diperoleh ke ruang yang mengandung Ca2 + ACSF yang lebih tinggi (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM penyangga natrium fosfat, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukosa, 4,0 ml mM CaCl dan pH 5,5 mM 7.4 siagang 310 sanggenna 320 mOsm). Simpanngi anjo irisang 20 sa'genna 30 menit sollanna akkulle ni pa'jari ammotere' riolo ri tenanapa ni rekam.
rekaman. Panggung mikroskop ni pasadia siagang kamara rekaman tette siagang lensa objektif immersi je'ne' 20x (Scientifica) nipakei untuk sikontu rekaman. Sel Purkinje yang dianggap diidentifikasi oleh (i) ukuran tubuh, (ii) lokasi anatomi serebelum, dan (iii) ekspresi gen reporter mtYFP fluoresen. Pipet tambalan siagang ketahanan ujung 5 sanggenna 11 megohms nitarik assulu ri kapiler kaca borosilikat (GB150-10, 0,86 mm×1,5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Jerman) siagang pipet horizontal Instruments (P-10000), Sutterva, CA). Sikontu rekaman nigaukangi ri ELC-03XS npi patch clamp amplifier (npi electronic GmbH, Tam, Jerman), yang dikontrol oleh perangkat lunak Signal (versi 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK). Anne paccoba ni rekam ri laju sampling 12,5 kHz. Sinyal ni saring siagang rua filter Bessel short-pass siagang frekuensi cutoff 1,3 siagang 10 kHz massing-massing. Kapasitas membran siagang pipet ni kompensasi ri sirkuit kompensasi ammake amplifier. Sikontu paccoba nigaukangi irawangang kendali kamera Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Jerman), yang ni kontrol ri perangkat lunak Hokawo (versi 2.8, Hamamatsu, Gerden, Jerman).
Konfigurasi siagang analisis sel-sel rutin. Riolo ri tenanapa ni rekam, isi pipet siagang larutan internal niaka zat-zat kamma anne: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM kalium glukonat, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (MM), 0,0 mM trifosit. (GTP) (Na) siagang 10,0 mM kreatinin fosfat nipantama ri pH 7,25, siagang tekanan osmotik 290 mOsm (sukrosa). Sikali-kali ribokoangna nipake gaya 0 pA untu' anreppeki membran, potensi membran istirahat ni ukkuru. Resistansi input ni ukkuru siagang arus hiperpolarisasi -40, -30, -20, siagang -10 pA. Ukkuruki lompona tanggapanna tegangan siagang pakei hukum Ohm untu' anghitung resistensi input. Aktivitas spontan ni catat ri penjepit tegangan 5 menit, siagang sPSC ni identifikasi siagang ni ukkuru ri Igor Pro (versi 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) ammake skrip pengenalan semi-otomatis. Kurva IV siagang arus steady-state ni ukkuru siagang anjepit batena ri potensial yang berbeda (appakkaramula battu ri -110 mV) siagang natambai tegangan ri langkah 5 mV. Produksi AP ni uji siagang nipake arus depolarisasi. Jepit sel ri -70 mV ri wattu ampakei pulsa arus depolarisasi. Atoroki ukurang langkahna massing-massing unit rekaman tassa'la' (10 sa'genna 60 pA). Nirekengi frekuensi AP maksimal siagang ni hitung secara manual lonjakan pulsa yang menyebabkan frekuensi AP tertinggi. Ambang batas AP ni analisis siagang ammake turunan kedua pulsa depolarisasi yang pertama memicu se're atau labbi AP.
Konfigurasi siagang analisis patch berlubang. Gaukangi rekaman patch berlubang ammake protokol standar. Pakei pipet bebas ATP siagang GTP yang tena na nia bahan-bahanna: 128 mM glukonat K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA siagang 2 mM MgCl2, siagang atoroki pH 7,2 (pake KOH). ATP siagang GTP nipelaki battu ri larutan intraseluler untuk anjagai permeabilitas membran sel yang tena na terkendali. Pipet tambalan niisi siagang larutan internal yang mengandung amphotericin (kira-kira 200 hingga 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) untuk mendapatkan catatan tambalan yang ditembak. Amphotericin ni larutkan ri dimetil sulfoksida (konsentrasi akhir: 0,1 sanggenna 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Konsentrasi DMSO ni pake tena na nia wassele signifikanna ri neuron nipelajari. Ri wattu proses tinju, resistensi saluran (Ra) tulusu ni pantau, siagang percobaan ni mulai ribokoangna amplitudo Ra siagang AP stabil (20-40 menit). Aktivitas spontan ni ukkuru ri tegangan siagang/atau penjepit arus 2 sanggenna 5 menit. Analisis data nigaukangi ammake Igor Pro (versi 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (versi 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) siagang GraphPad Prism (versi 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Amerika Serikat). Untu' angngassengi AP spontan, IgorPro's NeuroMatic v3.0c plug-in nipake. Otomatis identifikasi APs ammake ambang batas yang diberikan, yang disesuaikan secara individual untuk setiap catatan. Pakei interval spike, tentukan frekuensi spike siagang frekuensi spike instan maksimal siagang frekuensi spike rata-rata.
PN isolasi. Nasaba' a'adaptasi ri protokol le'baka nipa'nassai riolo, PNs ni murnikan battu ri otak kecil tikus ri tahap tertentu (58). Singkatna, serebelum ni bedah siagang ni cincang ri media disosiasi dinging es [tena HBSS Ca2+ siagang Mg2+, ni tambai 20 mM glukosa, penisilin (50 U/ml) siagang streptomisin (0,05 mg/ ml)], nampa ni cerna media ri papa [HBSS, HC-S, 1 · HC nitambai stein (1 mg / ml), papain (16 U / ml) siagang deoxyribonuclease I (DNase I; 0.1 mg/ml)] Nirawatang 30 menit ri 30°C. uru-uruna cuci jaringang ri media HBSS niaka lendir tello (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) siagang DNase (0,1 mg/ml) ri suhu kamar untu anjagai pencernaan enzimatik, nampa ri media HBSS niaka 20 mM glukosa Giling lembut ri HBSS peillinic, peillin (0,5/ml), strep (0.05 mg/ml) siagang DNase (0.1 mg/ml) ampasuluki sel tunggala. Suspensi sel yang dihasilkan disaring melalui saringan sel 70μm, kemudian sel-sel dipelet dengan sentrifugasi (1110 rpm, 5 menit, 4°C) dan disuspensikan kembali dalam media penyortiran [HBSS, ditambahkan dengan 20 mM glukosa, 20% janin sapi ) Serum, pelinik (50/5/5) strepillin (0.05 mg/ml)]; evaluasi kelangsungan hidup sel siagang propidium iodida siagang atoroki kepadatan sel 1×106 sanggenna 2×106 sel/ml. Riolo sitometri aliran, suspensi ni saring melalui saringan sel 50 μm.
Sitometer aliran. Pa'bageang sel nigaukangi ri 4°C ammake mesin FACSAria III (BD Biosciences) siagang perangkat lunak FACSDiva (BD Biosciences, versi 8.0.1). Suspensi sel ni urusi siagang nozzle 100 μm ilalang tekanan 20 psi ri laju ~2800 kajadian/detik. Nasaba kriteria gating tradisional (ukurang sel, diskriminasi bimodal, siagang karakteristik hamburan) anre' na'kulle ampa'tantui isolasi PN yang annaba battu ri jenis sel maraeng, strategi gating ni pasang berdasarkan perbandingan langsung intensitas YFP siagang autofluoresensi ri mitoYFP+ ​​siagang kontrol mitoYFP − Tikus. YFP ni eksitasi siagang ni radiasi sampel siagang garisi laser 488 nm, siagang sinyal ni deteksi siagang filter band pass 530/30 nm. Ri tikus mitoYFP+, kekuatan relatif gen reporter Rosa26-mitoYFP nipake tongi untu' ampa'bedaangi tubu neuronal siagang fragmen akson. 7-AAD ni eksitasi siagang laser kuning 561 nm siagang nideteksi siagang filter bandpass 675/20 nm untuk anre' na sel mate. Untu' ampasisa'laki astrosit ri wattu to'ji, suspensi sel niwarnai siagang ACSA-2-APC, nampa sampel ni radiasi siagang garisi laser 640 nm, siagang filter bandpass 660/20 nm nipake untu' angngassengi sinyal.
Sel-sel yang dikumpulkan dipelet dengan sentrifugasi (1110 rpm, 5 menit, 4°C) dan disimpan pada -80°C hingga digunakan. Tikus Mfn2cKO siagang ana'-ana'na nigolongangi ri allo se'rea untu' ampa'kurangi variabilitas prosedural. Pa'piitteang data FACS siagang analisis nigaukangi ammake perangkat lunak FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Sangkamma ni carita ri dallekang (59), PCR real-time ni pakei untuk angngisolasi DNA battu ri neuron ni urusi untuk kuantifikasi mtDNA ribokoangna. Linearitas siagang sensitivitas ambang batas ri uru-uruna niuji siagang anggaukangi qPCR ri nomoro sel yang berbeda. Singkatanna, pa'rappungang 300 PN ri penyangga lisis niaka 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 siagang proteinase K (200 ng/ml) nampa inkubasi ri 55°C 120 menit. Sel-sel ni inkubasi pole ri 95°C 10 menit untuk memastikan inaktivasi lengkap proteinase K. Pake probe TaqMan (Thermo Fisher) khusus untuk mt-Nd1, mtDNA ni ukkuru siagang PCR semi-kuantitatif ri sistem 7900HT Real-Time PCR (Thermo Fisher Fiscients). Sains, nomor katalog Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, nomor katalog AIVI3E8) siagang 18S (Thermo Fisher Scientific, nomor katalog Hs99999901_s1) gen.
Persiapan sampel proteom. siagang ampanaiki larutan ri 95°C 10 menit siagang sonikasi, ri penyangga lisis [6 M guanidin klorida, 10 mM tris(2-karboksietil) fosfin hidroklorida, 10 mM kloroasetamida siagang 100 mM tris-Lise beku pelet neuron HC]. Ri Bioruptor (Diagenode) 10 menit (30 detik pulsa / 30 detik periode jeda). Sampel ni encerkan 1:10 ri 20 mM tris-HCl (pH 8.0), nicampuru siagang 300 ng trypsin gold (Promega), siagang ni inkubasi bangngi ri 37°C untuk ampa'gannaki pencernaan lengkap. Ri allo maka rua, sampel ni sentrifugasi ri 20.000 g 20 menit. Supernatan ni encerkan siagang 0,1% asam formik, siagang larutan ni desalt siagang StageTips ni pa'jari kalenna. Sampel ni keringkan ri instrumen SpeedVac (konsentrator Eppendorf plus 5305) ri 45°C, nampa peptida ni suspensikan ri 0,1% asam formik. Sikontu sampel nipasadiai sikali-kali ri se'rea tau. Untu' ansalidiki sampel astrosit, 4 μg peptida desalted ni label siagang tandem mass tag (TMT10plex, nomor katalog 90110, Thermo Fisher Scientific) siagang rasio reagen peptida mange ri TMT 1:20. Untuk pelabelan TMT, 0,8 mg reagen TMT disuspensi ulang dalam 70 μl ACN anhidrat, dan peptida kering dikonstitusikan kembali menjadi 9 μl 0,1 M TEAB (trietilamonium bikarbonat), di mana 7 μl reagen TMT dalam ACN ditambahkan. Konsentrasina iamintu 43.75%. Punna lebaki 60 menit inkubasi, reaksi ni pamatei siagang 2 μl 5% hidroksilamin. Peptida yang berlabel dikumpulkan, dikeringkan, disuspensikan kembali dalam 200μl 0,1% asam formik (FA), dibagi dua, dan didesalti menggunakan StageTips yang dibuat sendiri. Pake UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph), sala se're battu ri ruaya bageang ni fraksikan ri kolom kromatografi Acquity 1mm x 150mm niisi siagang partikel C18 130Å1.7μm (Waters, katalog No SKU: 196636). Thermo Fisher Scientific). Pisahkan peptida dengan laju aliran 30μl/min, pisahkan dari 1% hingga 50% penyangga B selama 85 menit dengan gradien bertahap 96 menit, dari 50% hingga 95% penyangga B selama 3 menit, kemudian 8 menit untuk 95 % Penyangga B; Penyangga A iami antu 5% ACN siagang 10 mM amonium bikarbonat (ABC), siagang penyangga B iami antu 80% ACN siagang 10 mM ABC. Pa'rappungang fraksi tunggala 3 menit siagang pa'se'rei anjari rua kelompok (1 + 17, 2 + 18, kamma kammayya anne) nampa pa'je'ne'i ri sentrifugal vakum.
Analisis LC-MS/MS. Untuk spektrometri massa, peptida (nomor r119.aq) nipisangkai ri 25 cm, 75 μm diameter dalam kolom analitik PicoFrit (lensa objektif baru, nomor bagian PF7508250) dilengkapi dengan 1,9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ medium (Maischr, Maisch, UAS. 1200 (Thermo Fisher Scientific, Jerman). Kolom ni jagai ri 50°C. Penyangga A siagang B iamintu 0,1% asam formik ri laleng je'ne' siagang 0,1% asam formik ri 80% ACN, massing-massing. Peptida nipisangkai battu ri 6% sanggenna 31% penyangga B 65 menit siagang battu ri 31% sanggenna 50% penyangga B 5 menit siagang gradien 200 nl/min. Peptida yang dieluasi dianalisis pada spektrometer massa Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Peptida prekursor m/z pengukuran ni gaukangi siagang resolusi 120.000 ri kisaran 350 sanggenna 1500 m/z. Pake 27% energi tabrakan normal, prekursor kaminang kuat siagang keadaan muatan 2 sanggenna 6 nipile untuk pembelahan disosiasi perangkap C (HCD) energi tinggi. Wattu siklus ni pasang 1 s. Nilai m/z fragmen peptida ni ukkuru ri perangkap ion ammake target AGC kaminang ca'di 5×104 siagang wattu injeksi maksimal 86 ms. Punna lebaki fragmentasi, prekursor nipadongko ri daftar pengecualian dinamis 45 s. Peptida berlabel TMT dipisangkai pada 50 cm, 75 μm kolom Acclaim PepMap (Thermo Fisher Scientific, nomor katalog 164942), dan spektrum migrasi dianalisis pada spektrometer massa Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) yang dilengkapi dengan ion ion simetris medan tinggi (IMSFA) pakkakasa (Thermo Fisher Scientific) anjama ri rua tegangan kompensasi −50 siagang −70 V. MS3 nipile berdasarkan prekursor sinkronisasi ni pakei untuk pengukuran sinyal ion laporang TMT. Pemisahan peptida nigaukangi ri EASY-nLC 1200, ammake elusi gradien linier 90%, siagang konsentrasi penyangga 6% sanggenna 31%; penyangga A iamintu 0,1% FA, siagang penyangga B iamintu 0,1% FA siagang 80% ACN. Kolom analitis nioperasikan ri 50°C. Pakei FreeStyle (versi 1.6, Thermo Fisher Scientific) untuk ampasisa'laki file aslina situru' tegangan kompensasi FAIMS.
Identifikasi siagang kuantifikasi protein. Pake mesin pencari Andromeda terpadu, data aslina ni analisisi pake MaxQuant versi 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Ri tambanganna urutan Cre rekombinase siagang YFP nialle battu ri Aequorea victoria, spektrum fragmen peptida ni boyai untu urutan kanonik siagang urutan isoform proteom referensi tikus (Proteome ID UP000000589, ni unduh battu ri UniProt ri bulang lima taung 2017). Oksidasi metionin siagang asetilasi N-terminal protein ni pasang salaku modifikasi variabel; sistein karbamoil metilasi ni pasang salaku modifikasi tetap. Parameter pencernaan nipasangi ri “spesifisitas” siagang “tripsin/P”. Jumlah minimum peptida siagang peptida silet ni pake untuk identifikasi protein iamintu 1; jumlah minimum peptida unik iamintu 0. Ri sesena kondisi peptida peta cocok, tingkat identifikasi protein iamintu 0,01. Opsi “Peptida Kedua” ni aktifkan. Pakei opsi “cocok antara lari” untuk ampaletteki identifikasi sukses antara file asli yang berbeda. Pakei LFQ rasio minimum bilangang 1 untuk kuantifikasi bebas label (LFQ) (60). Intensitas LFQ ni saring untuk setidakna rua nilai valid ri setidakna se're kelompok genotipe ri massing-massing titik waktu, siagang ni ekstrapolasi battu ri distribusi normal siagang lebar. 0.3 siagang naung 1.8. Pakei platform komputasi Perseus (https://maxquant.net/perseus/) siagang R (https://r-project.org/) untuk ansalidiki wassele LFQ. Uji t moderat dua arah battu ri paket perangkat lunak limma ni pakei untuk analisis ekspresi diferensial (61). Analisis data eksploratif nigaukangi ammake ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally siagang pheatmap. Data proteomik berbasis TMT ni analisisi ammake MaxQuant versi 1.6.10.43. Pa'boyangi data proteomik mentah battu ri database proteomik manusia UniProt, yang diunduh pada bulan September 2018. Analisis termasuk faktor koreksi kemurnian isotop yang disediakan oleh pabrik. Pakei limma ri R untuk analisis ekspresi diferensial. Data asli, hasil pencarian database, siagang alur kerja analisis data siagang hasil yang ngaseng nipantama ri aliansi ProteomeXchange melalui repositori mitra PRIDE siagang pengidentifikasi set data PXD019690.
Anotasi fungsional ampa'gannaki analisis. Alat Analisis Jalur Kecerdasan (QIAGEN) ni pakei untuk ampattantui kekayaan istilah anotasi fungsional data set ri 8 minggu (Gambara 1). Singkatna, daftar protein kuantitatif nialle battu ri analisis data LC-MS/MS (spektrometri massa tandem) nipakei siagang kriteria filter kamma anne: Mus musculus nipile salaku spesies siagang latar belakang, siagang kategoriya ampa'piitteangi nilai P ni atoroki ri Benjamini untuk pengayaan 0,05 atau kurang ni anggap signifikan. Untuk grafik anne, lima kategori kelebihan tinggi ri massing-massing kluster berdasarkan nilai P yang disesuaikan ditunjukkan. Ammake t-test jaia, ammake program dorongang linier rua tahap Benjamini, Krieger, siagang Yekutieli (Q = 5%), analisis ekspresi protein kursus-waktu nigaukangi ri kandidat penting ni identifikasi ri massing-massing kategori, siagang massing-massing barisang ni analisis secara terpisah. Tena naparallu angngalle SD yang konsisten.
Untu' ampa'bandingi wassele'na anne pa'pilajaranga siagang database le'baka nipasulu' siagang appa'nia' diagram Venn ri gambara 1, nipa'se'rei daftar protein kuantitatif siagang anotasi MitoCarta 2.0 (24). Pakei alat online Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) untuk ampa'jari diagram.
Untuk informasi rinci tentang prosedur statistik yang digunakan untuk analisis proteomik, silahkan lihat bagian yang sesuai dari Bahan dan Metode. Untuk sikontu paccoba maraengannaya, informasi rinci akkullei nigappa ri legenda yang sesuai. Kecuali punna rie' pa'pau maraeng, sikontu dataya nipa'piitteang salaku rata-rata ± SEM, siagang sikontu analisis statistik nigaukangi ammake perangkat lunak GraphPad Prism 8.1.2.
Untuk bahan tambahan untuk artikel ini, silahkan lihat http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
anne iami antu artikel akses terbuka ni distribusikan ri sesena paratorang Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, yang memungkinkan penggunaan, distribusi dan reproduksi dalam media apa pun, asalkan penggunaan terakhir tidak untuk keuntungan komersial dan premisnya adalah bahwa karya aslinya benar. Referensi.
Catatang: Ikatte appalakki bawang ri kau sollanna nupassareang alamat emailnu sollanna tau nu rekomendasikan mange ri halamanga naisse'i angkanaya ero'nu nacini' emailnu siagang teai spam. Ikatte tena na la angngalle alamat email.
anne pakkuta'nang ni pakei untu' anuji punna ikatte tau battu siagang anjagai pa'sareang spam otomatis.
Ri E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Analisis proteomik neuron disfungsional napa'butti angkua program metabolisme ni aktifkan untuk angngewai neurodegenerasi.
Ri E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Analisis proteomik neuron disfungsional napa'butti angkua program metabolisme ni aktifkan untuk angngewai neurodegenerasi.
©2020 Asosiasi Amerika untuk Kemajuan Sains. sikontu ha'na nijaga. AAAS iami antu pa'samaturukang HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef siagang COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.