Kamma kammayya anne†Alamat kamma kammayya anne: OX11 0DE, Inggris, Bangunan Berlian, Taman Sains siagang Inovasi Harwell, Dietcote, Oxfordshire, Inggris, Sumber Cahaya Berlian Co., Ltd., Pusat Pencitraan Biologis Elektronik.
Pusat reaksi kompleks panen cahaya 1 (RC-LH1) iami antu komponen fotosintesis inti bakteri fototrofik ungu. Ikatte ampa'nassai rua struktur mikroskop krio-elektron kompleks RC-LH1 battu ri Rhodopseudomonas palustris. Struktur resolusi 2,65-Å kompleks RC-LH114-W terdiri dari 14 loop subunit LH1 yang mengelilingi RC, yang diganggu oleh protein W, sementara kompleks tanpa protein-W adalah komposisi RC sepenuhnya yang mengelilingi RC. Nitutui 16 subunit LH1 loop. Pa'bandingangna anne struktura assarei pa'pahang ri sesena dinamika kinona ri kompleks RC-LH1, antama' tongi pa'pinraang konformasional tenayapa nitantu riolo ri wattu ansikkoki kinona ri situs RC QB, kammayatompa tampa'na situs ikatan kinona bantu, nu'bantua ampa'letteki mange ri RC. Struktur unik protein W anre' na'kulle nitutu' loop LH1, na'kulle a'pa'nia' salurang untu' ampa'jari pila' gassing pertukaran quinone/quinolone.
Energi nipassareanga ri fotosintesis akkullei ampaentengi sanna' jaina katallassang ri lino, siagang sanna' lompona potensina untu' bioteknologi surya. Ri wattu na promosikan fotosintesis global, bakteri fototrofik ungu na pa'piitteang tongi a'rupa-rupaya mode energi siagang kemampuan metabolisme. Iamintu akkullei angngewai fotosintesis siagang attimbo salaku bakteri heterotrofik ri wattu sassanga, akkullei ampakabajiki nitrogen siagang karbon dioksida, appabattu hidrogen, siagang ampakarugi senyawa aromatik (1-3). Untu assarei energi untuk proses-proses kammaya anne, cahaya musti lintaki siagang baji nipinra ajari energi kimia. Anne prosesna appakkaramulai ri wattu kompleks antena penjebakan cahaya anseroi cahaya siagang ampaletteki energi yang terjebak mange ri pusat reaksi (RC), jari appakkaramulami pemisahan muatan (4 – 7). Unit dasar fotosintesis ri bakteri fototrofik ungu nibangung battu ri tipe 2 RC, ni lingkari ri kompleks panen cahaya 1 (LH1), a'bentu' kompleks inti RC-LH1. LH1 ni bentu ri array heterodimer αβ melengkung, massing-massing a'samaturu rua klorofil bakteri (BChl) a molekul siagang se're iareka rua karotenoid (8-12). Antena LH1 kaminang sederhana iamintu 16 atau 17 heterodimer αβ yang mengelilingi RC (9-13) dalam lingkaran tertutup, tetapi di kompleks inti lainnya, peptida transmembran mengganggu kontinuitas LH1 yang mengelilingi, sehingga meningkatkan difusi kinol/kinon antara RC dan sitokrom bc kompleks (1111, 13). Tanaman fototrofik ungu Rhodopseudomonas (Rps.) iami antu organisme model yang akkulle ampahangi energi siagang transfer elektron yang antulungi fotosintesis. Struktur kristal maka se'rena Rps. Model kompleks palustris RC-LH1 iami antu RC, ni lingkari ri 15 loop LH1 heterodimerik, yang ni ganggu ri protein yang tena ni isse' niarenga “Protein W” (14). Protein-W ribokoangna ni identifikasi salaku RPA4402, iami antu protein 10.5kDa yang tena ni ciri siagang tallu heliks transmembran (TMH) ni prediksi (16). Ikatte a'pa'nassa untu' a'pinra areng gen rpa4402 ankode protein W a'jari pufW sollanna a'samaturu' siagang nomenklatur ni pake untu' gen ankode RC-L, M (pufL, pufM) siagang LH1α, β (pufA, pufB) subunit. Na menarikna, protein-W rie'ji bawang ri 10% RC-LH1, ampa'piitteang Rps. palustris appabattu rua kompleks RC-LH1 yang berbeda. Anrinni, ki laporkan struktur cryo-EM (cryo-EM) resolusi tinggi battu ri ruaya kompleks inti, se're siagang protein W siagang 14 αβ heterodimer, se're pole tena protein W siagang 16 Heterodimer LH1 loop tertutup. Strukturta a'wakilkangi pa'pinraang pa'pahang ri sesena RC-LH1 kompleks Rps. palustris, nasaba lebaki nianalisis populasi homogen massing-massing varian siagang nia resolusi sukku untu ampa'nassai massing-massing peptida siagang pigmen terikat siagang lipid siagang kinon terkait. Pa'bandingangna anne struktura ampa'piitteangi angkua tallu protein TMH-W yang tenayapa ni gappa ri kompleks RC-LH1 maraeng sa'genna kamma-kamma anne appa'nia' salurang kinon untu' ampa'gassingi pa'tukaranna kinon/kinon. Sipa'gang situs pengikatan lipid siagang kinon yang terkonservasi telah diidentifikasi, dan kami telah mengungkapkan perubahan konformasi baru setelah kombinasi kinon dan RC, yang mungkin cocok untuk fotosistem II (PSII) RC dari organisme fototrofik beroksigen. Temuan ikatte assarei pahang beru ri sesena kinetika pengikatan siagang pertukaran quinone/quinolone ri kompleks inti RC-LH1 bakteri fototrofik ungu.
Untu' ampa'sadiai pa'pilajarang rinci ri sesena ruaya kompleks ni gappa ri Rps. palustris, ikatte angisolasi massing-massing RC-LH1 siagang cara biokimia. Kompleks kurang protein W (ribokoangna nikana ΔpufW) ni murnikan battu ri strain yang kurang gen pufW (16), siagang se'reji kompleks RC-LH1 akkulle ni pa'jari. Protein W-niaka kompleksna ni pa'jari ri se'rea strain. Protein W battu ri anne strain nipinrai siagang 10x His tag ri C-terminusna, sa'genna kompleks protein W-na akkullei nipasicampuru' siagang protein W yang kurang siagang logam imobilisasi. Kompleks nipisangkai secara efektif (16) Kromatografi Afinitas (IMAC).
Sangkamma ni cini' ri gambara 1, ruaya kompleks nia tallu sub-unit RC (RC-L, RC-M siagang RC-H) ni lingkari ri antena LH1. Struktur 2.80-A kompleks kurang protein-W ampa'piitteang 16 αβ heterodimer, a'bentu' loop LH1 tertutup sukku' angkulilingi RC, ribokoangna nikana kompleks RC-LH116. Struktur 2,65Å kompleks protein-W-na nia 14-heterodimer LH1 ni ganggu ri protein-W, ribokoangna nikana RC-LH114-W.
(A siagang B) Representasi permukaan senyawa. (C siagang D) Pigmen terikat ni ekspresikan ri batang. (E siagang F) Kompleks ni cini battu ri tompo sitoplasma nia peptida siagang subunit LH1 niwakili ri kartun, siagang ni nomoro searah jarum jam battu ri celah protein-W [konsisten siagang nomoro Rba. sphaeroides complex (13)]. Untuk LH1-α, warna subunit protein iamintu kuning; untuk LH1-β, warna subunit protein iamintu biru; untuk protein-W, proteinna a'ra'; untuk RC-H, iami antu cyan; untuk RC-L, iami antu oranye; untuk RC-M, magenta. Kofaktor niwakili ri batang, eja a'wakilkan BChl siagang BPh a molekul, ungu a'wakilkan karotenoid, siagang kuning a'wakilkan molekul UQ10. (G siagang H) Pa'cinikang lompo ri celah protein-W ri daera setara kompleks RC-LH114-W (G) siagang kompleks RC-LH116 (H). Kofaktor ni pa'piitteang ri bentu' pengisian ruang, kinona chelated ni pa'piitteang ri warna biru. Celah protein-W ni sorongi siagang garisi putus-putus biru ri (G), siagang lubang-lubang ca'di ri tampa'na quinone/quinolol a'la'bang ri cincin LH116 ni sorongi siagang garisi putus-putus kebo ri (H).
Gambar 1 (A siagang B) ampa'piitteangi RC ni lingkari ri array tabbukka iareka ta'tutu' LH1αβ heterodimer, massing-massing a'samaturu' rua BChl siagang se're karotenoid (Gambara 1, C siagang D). Studi rioloa ampa'piitteangi angkua Rps iami antu kompleks LH1. Ri jalur biosintesis spirulina xanthin, spesies anne nia populasi campurang karotenoid (17). Mingka, spiropyrroxanthin iami antu karotenoid dominan siagang kepadatanna sukku. Jari, ammile maki modele spiroxanthin ri sikontu situs pengikatan LH1. Polipeptida alfa siagang beta iami antu TMH tunggal siagang daerah pantarang membran sike'de' (Gambara 1, A, B, E, siagang F). Manna pole densitas 17 residu ri C-terminus tena niparessai, polipeptida alfa ni belah battu ri Met1 mange ri Ala46 ri ruaya kompleks. β polipeptida ni kurangi battu ri Gly4 mange ri Tyr52 ri RC-LH116, siagang battu ri Ser5 mange ri Tyr52 ri RC-LH114-W. Tena densitas 3 atau 4 N-terminal atau 13 C-terminal residu yang diamati (Gambar S1). Analisis spektrometri massa kompleks RC-LH1 campurang ni pasadia battu ri strain tipe liar ampa'piitteangi angkua daerah yang hilang iami antu wassele'na pembelahan heterolog peptida-peptida anne (Gambara S1 siagang S2). Formilasi N-terminal α-Met1 ni cini tongi (f). Analisisna ampa'piitteangi angkua α-peptida niaki ri residu fMet1 mange ri Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, siagang β-peptida niaki ri residu Ser2 mange ri Ala53, ia niaka ri sesena peta kepadatan EM suhu-rendah.
Koordinasi α-His29 siagang β-His36 ampa'jari BChls a'dalle' mange ri dallekang; massing-massing αβ heterodimer a'rappungang siagang tetanggana untu' a'bentu' loop tabbukka (RC-LH114-W) atau loop tertutup (RC-LH116) ri tammulilina RC Array pigmen berpasangan eksiton (Gambara 1, C siagang D). Punna nipasibandingi siagang pita 877 nm RC-LH114-W, 880 nm pergeseran merah absorpsi RC-LH116 iamintu 3 nm (Gambara 2A). Mingka, spektrum dikroisme lingkaran sanna' sangkamma (Gambara 2B), a'nassai angkua manna pole rie' sisalana loop tabbukka siagang ta'tutu, lingkungang lokal BChls sanna' sangkamma. Absorpsi redshift akkullei ajari wassele battu ri kurangna gerakang termal siagang natambai stabilitas ri loop tertutup (18, 19), perubahang kopling pigmen nasaba loop tertutup (20, 21), atau kombinasi battu ri ruaya efek (11).
(A) Spektrum absorpsi ultraviolet/visible/dekat-inframerah, puncakna ni tanrai siagang pigmen yang sesuai siagang ni normalkan mange ri puncak BPh ri 775 nm. (B) Spektrum dikroisme lingkaran ni normalkan mange ri absorbansi BChl ri 805 nm. (C siagang D) Spektrum ΔA nipile battu ri spektrum absorpsi yang diselesaikan waktu dari kompleks RC-LH114-W (C) dan kompleks RC-LH116 (D). Untuk perbandingan yang lebih baik, semua spektra dinormalisasi ke ∆A dari −A pada 0,2 ps. (E) Laju oksidasi sitokrom c2 ribokoangna iradiasi ri dallekanna konsentrasi UQ2 (ciniki gambara S8 untuk data mentah). (F) Ri sel-sel ni tumbuh ri tangnga-tangngana cahaya intensitas rendah, sedang atau tinggi (10, 30 atau 300μMm-2 s-1, masing-masing), subunit protein W dan RC-L dalam kompleks yang dimurnikan dan rasio membran yang dipisah. Pattentui tingka protein siagang SDS-poliakrilamida gel elektroforesis siagang imunoassay (ciniki gambara S9 untuk data mentah). Tentukan rasio relatif terhadap kompleks RC-LH114-W yang dimurnikan. Rasio stoikiometri RC-L mange ri protein-W kompleks iamintu 1:1.
BChls ri posisi 1 ri loop αβ14 cacat RC-LH114-W (Gambara 1, A, C, siagang E) labbi ambani ri donor utama RC (P) 6,8Å na BChls setara ri RC-LH116 (Gambara 1, B, D, siagang F, siagang S3); mingka, kinetika absorpsi transient battu ri ruaya kompleks ampa'piitteangi angkua untuk RC-LH114-W siagang RC-LH116, konstanta wattu transfer energi eksitasi battu ri LH1 mange ri RC iamintu 40 ±4 siagang 44±3 ps (Gambara 2). , C siagang D, gambara S4 siagang tabel S2). Tena todong sisalana signifikan ri transfer elektronik lalang RC (Gambara S5 siagang teks tambahan terkait). Ikatte ancurigai angkua korespondensi rapi'na wattu pa'lettekang energi ri alla'na LH1 siagang RC-P nasaba' sangkammai bellana, sudu'na siagang energi potensialna BChl ri ruaya loop LH1. Kamma-kamma anne anjariang pola energi LH1 untu' anrapi'i jarak minimum tena na la'bi gassing na transfer energi langsung battu ri situs suboptimal mange ri RC. Loop LH1 open-loop ri RC-LH114-W akkulle tongi nalaloi gerakang termal yang tena na signifikan ilalang kondisi suhu rannu untuk analisis struktural, siagang rie' konformasi cincin αβ14 labbi lantang ri suhu kamar battu ri jarak pigmentasi βBChls ri posisi RC 1.
Kompleks RC-LH116 nia 32 BChls siagang 16 karotenoid, siagang susunangna sanna' sangkammai siagang nigappaya battu ri Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) strain PDB (IDC 797) (2977) siagang ganggang ijo (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Punna lebaki ni pasangkamma, sike'de'ji bawang penyimpangan ri posisi αβ heterodimer ni cini', terutama 1-5, 15, siagang 16 (Gambara S6). Niakna protein-W nia dampakna signifikan ri struktur LH1. Tellu TMH-na nipasisambungi siagang loop sike'de', siagang N-terminal ri sa'ri lumen kompleks siagang C-terminal ri sa'ri sitoplasma (Gambara 1A siagang 3, A sa'genna D). Protein-W sanna'i hidrofobik (Gambara 3B), siagang TMH2 siagang TMH3 a'samaturu' siagang LH1αβ-14 untu' a'bentu' permukaang transmembran (Gambara 3, B siagang E mange ri G). Antarmuka utamana nibangung battu ri residu Phe, Leu siagang Val ri daera transmembran. Residu anne ni susun siagang asam amino hidrofobik siagang pigmen αβ-14. Sipa'gang residu polar a'sare tongi kontribusi ri interaksi, antama' tongi ikatan hidrogen antara W-Thr68 siagang β-Trp42 ri tompo'na rongga kompleks (Gambara 3, F siagang G). Ri tompo'na sitoplasma, Gln34 niaki ri ampi'na kelompok keto αβ-14 karotenoid. Nampa pole, molekul n-dodesil β-d-maltoside (β-DDM) ni selesaikan, siagang ekor hidrofobikna a'la'bangi mange ri antarmuka antara protein-W siagang αβ-14, siagang ekor lipid akkullei niaki ri batang kale. Ikatte to'ji anciniki angkua daerah resolusi C-terminal protein W siagang RCH sanna' siampi'na, mingka anre' na'kulle antama' ri lingkup a'bentu' interaksi spesifik (Gambara 1, A siagang E). Mingka, akkullei rie' interaksi ri asam amino C-terminal yang tenapa ni selesaikan battu ri ruaya protein, yang akkullei assarei mekanisme untuk rekrutmen protein-W ri wattu perakitan kompleks RC-LH114-W.
(A) Protein-W, yang menghadapi antarmuka dengan LH1αβ14 dalam bentu kartun, memiliki rantai samping berbentuk batang (merah), ditampilkan dalam bagian diagram potensial elektrostatik (permukaan abu-abu transparan dengan tingkat kontur 0,13). (B) Protein-W niwakili ri permukaan berwarna hidrofobik. Daerah polar siagang bermuatan ni pa'piitteang ri warna cyan, daerah hidrofobik ni pa'piitteang ri warna pute, siagang daerah hidrofobik kuat ni pa'piitteang ri warna oranye. (C siagang D) Protein-W niwakili ri kartun, orientasina sangkamma ri (A) (C), siagang nipinra 180° (D). Situru posisi ri urutan, residu yang dapat dibedakan menggunakan skema warna pelangi, di mana N-terminal berwarna biru dan C-terminal berwarna merah. (E) Protein-W ri pa'cinikang sangkamma ri (A), siagang residu ri antarmuka protein-W:LH1 niwakiliki ri batang siagang tanra-tanra nipasang. (F) Protein-W nipinra 90° relatif mange ri (E) siagang LH1αβ14 ri representasi kartun, siagang relatif mange ri residu antarmuka ri representasi batang. Residu yang tergantung dari polipeptida beta diberi label. Kofaktor ni pa'piitteang salaku bar yang cocok siagang warna gambara 1, β-DDM yang terurai ni pa'piitteang abu-abu, siagang oksigen ni pa'piitteang warna mera. (G) Paccini ri (F) ni putar 180°, siagang residu yang menonjol dari polipeptida alfa berlabel.
Protein-W ansambeangi heterodimer αβ (15 ri gambara 1F), sa'genna anre' na'kulle nitutu loop siagang a'miring tallu heterodimer αβ uru-urua. Ni cini'i angkua sudut kemiringan maksimal heterodimer αβ-1 maka se're relatif mange ri film normal iamintu 25° sanggenna 29° (Gambara 1, A siagang E), nu ni bentu' ri kemiringan 2° sanggenna 8° αβ-1 ri RC A kontras tajam-LH116 (Gambara 1, B siagang F). Heterodimer maka rua siagang maka tallu miring ri 12° mange ri 22° siagang 5° mange ri 10°, massing-massing. Lanri halangan sterik RC, kemiringan αβ-1 tena na antama pasangan kedua αβ (yang sesuai dengan αβ ke-16 di Gambar 1F), sehingga membentuk celah yang jelas di cincin LH1 (Gambar 1, A dan E) . Lanri kurangna rua αβ heterodimer, ni dampingi siagang tappela appa BChl siagang rua karotenoid, tena manna sitau karotenoid a'samaturu' ri subunit αβ-1 a'pinra, na'jari cincin LH114-W niaka 13 karotenoid Vegetarian siagang 28 BChls. Perkiraan resolusi lokal battu ri ruaya kompleks ri αβ1 sa'genna 7 daerah labbi rannu naia loop LH1 maraengannaya, nu'kullea a'pa'piitteang plastisitas bawaan subunit LH1 ri ampi'na situs RC QB (Gambara 4).
Gambara RC-LH114-W (A siagang B) siagang RC-LH116 (C siagang D) ni pa'piitteang battu ri pa'cinikang rate/pa'piitteang ri sa'ri (A siagang B) (A siagang C) siagang tompo' rongga gambara 1. (B siagang D). Kunci berwarna ni pa'piitteang ri kanang.
Kompleks inti karakteristik maraeng siagang rasio stoikiometri 1:14 iami antu Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX dimer (13). Mingka, protein W siagang PufX tena homologi yang jelas, siagang nia dampak signifikan ri struktur LH1 massing-massing. PufX iami antu TMH tunggal siagang domain sitoplasma N-terminal yang berinteraksi siagang sisi sitoplasma subunit RC-H (13) ri posisi yang sesuai dengan Rps. palustris LH116αβ-16. PufX appaentengi salurang untuk pertukaran kinon/kinolon antara RC-LH1 siagang kompleks sitokrom bcl siagang niaki ri sikontu Rba. kompleks inti sphaeroides (13). Manna pole antarmuka monomer-monomer niaki ri Rba. Dimer sphaeroides RC-LH1-PufX niaki ri posisi pengikatan protein W ri RC-LH114-W, siagang celah ni induksi ri PufX siagang protein-W niaki ri posisi setara (Gambara S7A). Celah ri RC-LH114-W sanna tongi sejajar siagang saluran kinon hipotetis (8) Pseudomonas rosea LH1, yang ni bentu ri peptida yang tena na sicoco siagang protein W atau PufX (Gambara S7B). Nampa pole, saluran quinone ri Blc. LH1 berwarna hijau zamrud yang dibentuk dengan tidak termasuk satu subunit γ (7) terletak di posisi yang sama (Gambar S7C). Manna pole ni mediasi ri protein yang berbeda, penampilan saluran kinon/kinolol ini di posisi yang sama dalam kompleks RC-LH1 tampaknya menjadi contoh evolusi konvergen, menunjukkan bahwa celah yang dibuat oleh protein W dapat bertindak sebagai saluran kinon.
Celah ri loop LH114-W akkullei a'bentu' daera membran tulusu' ri alla'na ruang internal kompleks RC-LH114-W siagang membran massal (Gambara 1G), naia a'hubbungi ruaya domain ilalang pori protein sangkamma ri protein. Kompleks RC-LH116 sangkammai Tch tertutup. Kompleks sangkamma jarum (22) (Gambara 1H). Nasaba difusi quinone melalui membran labbi gassing na difusi melalui saluran protein sempit, loop LH114-W terbuka akkullei ampa'jari RC turnover labbi gassing na loop LH116 tertutup, siagang difusi quinone antama ri RC akkullei labbi ni batasi. Untu' anuji punna protein W a'kulle a'jari konversi kinon ilalang RC, nigaukangi assay oksidasi sitokrom ri konsentrasi tertentu ubiquinone 2 (UQ2) (analog UQ10 alami siagang ekor isoprene la'bi sike'de') (Gambara 2E). Manna pole rie'na quinone chelated na halangi penentuan akurat konstanta Michaelis (RC-LH114-W siagang RC-LH116 cocoki untuk 0,2±0,1μM siagang 0,5±0,2μM, massing-massing), tingkat maksimal RC-LH114-W ( 4,6±0,2014-W) iamintu s-LH114-W. 28±5% lompoangngang na RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
Ri uru-uruna ni perkirakan angkua protein-W niaki ri kira-kira 10% battu ri kompleks inti (16); anrinni, tingka' pammantanganna sel-sel pa'bakka'na cahaya-cahaya ca'di, cahaya-tengnga, siagang cahaya tinggi iamintu 15±0,6%, 11±1% siagang 0,9±0,5, massing-massing % (Gambara 2F). Pa'bandingang kuantitatif spektrometri massa ampa'piitteangi angkua pa'tambaang tag histidin anre' na kurangi kelimpahan relatif protein-W punna nipasibandingi siagang strain tipe liar (P = 0,59), jari anne tingka'na teai artefak protein-W nipinra (Gambara S10). Mingka, anne pa'bangngiang protein-W ri kompleks RC-LH1 akkullei na pa'kulleang siapa are RC a'lette' ri tingka' a'la'bang, sa'genna akkullei na kurangi pertukaran quinone/quinolone la'bi lambat ri kompleks RC-LH116. Ikatte anciniki angkua tinggina tingka' pa'bangngiang cahaya anre' nasangkamma siagang data transkriptomik beru-berua, nu'pa'piitteang angkua ekspresi gen pufW nai' ri tangnga-tangngana cahaya kuatta (Gambara S11) (23). Sisalana transkripsi pufW siagang protein-W antama ri kompleks RC-LH1 a'jari pa'bissa-bissa siagang akkullei a'pa'piitteang pangatorang kompleks protein.
Ri RC-LH114-W, 6 kardiolipin (CDL), 7 fosfatidilkolin (POPC), 1 fosfatidilgliserol (POPG) siagang 29 molekul β-DDM ni allokasi siagang ni modele ri 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG siagang 12 DMD. RC-LH116 (Gambara 5, A siagang B). Ri ruaya struktur, CDL sanna'i niaki ri sisi sitoplasma kompleks, nampa POPC, POPG siagang β-DDM sanna'i niaki ri sa'ri luminal. Rua molekul lipid siagang deterjen ni isolasi ri αβ-1 mange ri αβ-6 daerah kompleks RC-LH114-W (Gambara 5A), siagang lima niisolasi ri daerah setara RC-LH116 (Gambara 5B). Labbi jai lipid ni gappa ri sa'ri maraenna kompleks, terutama CDL, ni pa'rappungang ri alla RC siagang αβ-7 mange ri αβ-13 (Gambara 5, A siagang B). Lipid siagang deterjen yang terselesaikan secara struktural lainnya terletak di luar cincin LH1, dan rantai asil yang terselesaikan dengan baik membentang di antara subunit LH1, sementara ditunjuk sebagai β-DDM di RC-LH114-W, dan didefinisikan sebagai β-DDM di RC A campuran β-DDM dan POPC-LH166. Posisi yang sama lipid kelating siagang deterjen ri strukturta ampa'nassai angkua iami antu situs pengikatan yang relevan secara fisiologis (Gambara S12A). Posisi molekul setara ri Tch rie' to'ji konsistensi baji'na. Lembut siagang Trv. Galur 970 RC-LH1s (Gambara S12, B sa'genna E) (9, 12) siagang residu ikatan hidrogen kelompok ulu lipid ampa'piitteang konservasi yang cukup baji' ri pa'samaturukang urutan (Gambara S13), a'nassai angkua CDL yang terkonservasi yang mengikat ke RC (24), situs-situs ini dapat dilestarikan dalam kompleks RCH-LH1.
(A siagang B) RC-LH114-W (A) siagang RC-LH116 (B) peptida niwakili ri kartun, siagang pigmen niwakili ri batang, ammake skema warna ri gambara 1. Lipid ni pa'piitteang ri warna eja, siagang deterjen ni pa'piitteang ri warna abu-abu. UQ ni ikat ri situs RC QA siagang QB iami antu kuning, sementara UQ terisolasi iami antu biru. (C siagang D) Pa'pahang sangkamma (A) siagang (B), siagang lipid nipelaka. (E mange ri G) Pa'cinikang lompo Q1(E), Q2(F) siagang Q3(G) battu ri RC-LH116, siagang rantai samping yang massing-massing a'pangaru. Ikatan hidrogen ni pa'piitteang salaku garis putus-putus itang.
Ri RC-LH116, RC QA siagang QB UQ, yang amminawang ri transfer elektron ri proses pemisahan muatan, ni dekomposisi ri tampa pengikatanna. Mingka, ri RC-LH114-W, QB quinone tenapa na ni selesaikan siagang lani bicarai secara rinci ri yawa. Ri tambanganna QA siagang QB quinones, rua molekul UQ chelated (niaka ri allakna cincin RC siagang LH1) ni allokasikan ri struktur RC-LH114-W situru kelompok ulu yang terselesaikan baji (niaka ri Q1 siagang Q2, massing-massing). langit). Gambar 5C). rua unit isoprene ni tugaskan mange ri Q1, siagang peta kepadatan a'pa'le'baki 10 ekor isoprene lengkapna Q2. Ri struktur RC-LH116, tallu molekul UQ10 chelated (Q1 sanggenna Q3, gambara 5D) ni selesaikan, siagang sikontu molekul nia densitas je'ne'na ri sikontu ekor (gambara 5, D sanggenna G). Ri ruaya struktur, posisi kelompok ulu quinone Q1 siagang Q2 nia konsistensi yang sanna baji'na (Gambara S12F), siagang ia bawang a'samaturu' siagang RC. Q1 niaki ri pakkebuka celah W RC-LH114-W (Gambara 1G siagang 5, C, D siagang E), siagang Q2 niaki ri ampi'na tampa' pa'bissa QB (Gambara 5, C, D) siagang F). Residu L-Trp143 siagang L-Trp269 yang dilestarikan sangat dekat dengan Q1 dan Q2 dan memberikan interaksi π-stacking potensial (Gambar 5, E dan F, dan Gambar S12). L-Gln88, 3.0 Å battu ri oksigen distal Q1, assarei ikatan hidrogen kuat (Gambara 5E); anne residua ni konservasi ri sikontu RC pantaranganna hubungang kaminang bellaya (Gambara S13). L-Ser91 secara konservatif ni ganti Thr ri se'reang RC maraeng (Gambara S13), iamintu 3,8 Angstroms battu ri oksigen metil Q1, siagang akkullei assarei ikatan hidrogen lammai (Gambara 5E). Q3 anre' na rie' interaksi spesifik, mingka niaki ri daerah hidrofobik ri allakna subunit RC-M siagang subunit LH1-α 5 sanggenna 6 (Gambara 5, D siagang G). Q1, Q2 siagang Q3 atau quinones chelated ri ampi'na rie' to'mi ni selesaikan ri Tch. Lembut, Trv. Strain 970 siagang Blc. Struktur iris (9, 10, 12) a'pa'piitteang situs pengikatan kinon bantu yang dilestarikan ri kompleks RC-LH1 (Gambara S12G). Lima UQ terurai ri RC-LH116 sanna' baji'na siagang 5,8±0,7 battu ri massing-massing kompleks ni tentukan ri kromatografi cair tinggi kinerja (HPLC), sementara tallu UQ terurai ri RC-LH114-W labbi rannu na Nilai ni ukkuru 6,2±0,3 (Gbr. S14) a'nassai angkanaya anre' na'kulle niurangi molekul UQ. struktur.
Polipeptida L siagang M pseudo-simetris massing-massing nia lima TMH siagang a'bentu heterodimer yang a'gabung se're dimer BChl, rua monomer BChl, rua monomer bakteriofag (BPh), siagang se're besi non-Heme siagang se're iareka rua molekul UQ10. Lanri nia ikatan hidrogen ri kelompok keton terminal siagang akumulasi ni isse' ri Rps, karotenoid nipantama ri M-subunit, niarenga cis-3,4-dehydroorhodopin. Spesies (25). Domain membran luar RC-H ni jangkar ri membran ri se're TMH. Struktur RC secara keseluruhan sangkammai siagang tallu subunit RC spesies terkait (sangkamma Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Siklus makro BChl siagang BPh, tulang punggung karotenoid siagang besi non-heme tumpang tindih ri laleng rentang resolusi struktur anne, kamma to'ji kelompok ulu UQ10 ri situs QA siagang quinone QB ri RC-LH116 (Gambara S15).
Ketersediaan rua struktur RC siagang tingkat penghunian situs QB yang berbeda memberikan kesempatan baru untuk memeriksa perubahan konformasi konsisten yang menyertai pengikatan quinone QB. Ri kompleks RC-LH116, QB quinone niaki ri posisi “proksimal” yang penuh terikat (26), mingka pemisahan RC-LH114-W tena QB quinone. Tena QB quinone ri RC-LH114-W, yang mengejutkan karena kompleksnya aktif, lebih dari kompleks RC-LH116 dengan QB quinone yang terselesaikan secara struktural. Manna pole anjo ruaya cincin LH1 a'kelat kira-kira annang kinon, lima a'kulle ni pa'le'ba' secara struktural ri cincin RC-LH116 tertutup, sementara talluji bawang a'kulle ni pa'le'ba' secara struktural ri cincin RC-LH114-W terbuka. Anne gangguan struktural yang meningkat mungkin mencerminkan penggantian situs QB RC-LH114-W yang lebih cepat, kinetika quinone yang lebih cepat dalam kompleks, dan peningkatan kemungkinan melintasi loop LH1. Ikatte a'pau angkua kurangna UQ ri situs RC QB RC-LH114-W akkullei a'jari wassele'na kompleks yang labbi kompleks siagang labbi aktif, siagang situs QB RC-LH114-W le'ba'mi langsung ni beku ri pergantian UQ Tahap khusus (pintu antama' ri situs QB le'ba'mi ni tutup) a'pa'piitteang konformasi aktivitas anne.
Punna tena QB, rotasi L-Phe217 anrurungangi mange ri posisi yang tena na sicoco siagang pengikatan UQ10, nasaba anjo la'jari tabrakan spasial siagang unit isoprene maka se're ri boko (Gambara 6A). Nampa pole, anjo konformasi utama yang jelas jelas, terutama helix de (helix pendek dalam loop antara TMH D dan E) di mana L-Phe217 digeser ke kantong pengikatan QB dan rotasi L-Tyr223 (Gambar 6A) Untuk memutuskan ikatan hidrogen dengan kerangka pengikatan M-A4 dan menutup masukan pengikatan QB tampa (Gambara 6B). Helix de a'pinra ri dasara, Cα L-Ser209 a'lette' 0,33Å, nampa L-Val221Cα a'lette' 3,52Å. Tena na rie' pa'pinraang nu'kullea ni cini' ri TMH D siagang E, nu'kullea ni tumpang ri ruaya struktur (Gambara 6A). Sanggenna ni isse', iami antu struktur maka se're ri RC alami nu antongkoki situs QB. Pa'bandingang siagang struktur lengkap (QB-bound) ampa'piitteangi angkua riolo quinone ni kurangi, parallui nipinra konformasi sollanna akkulle antama' ri quinone. L-Phe217 a'pinra untu' a'bentu' interaksi π-stacking siagang kelompok ulu quinone, siagang heliks a'lette' mange ri pantarang, na'kulleang rangka L-Gly222 siagang rantai samping L-Tyr223 a'bentu' jaringan ikatan hidrogen siagang struktur ikatan hidrogen stabil (Gambara 6, A siagang C).
(A) Kartun tumpang tindih hologram (rantai L, rantai oranye/M, magenta) siagang struktur apo (abu-abu), ri antere residu kunci ni pa'piitteang ri bentu' representasi sangkamma batang. UQ10 niwakiliki siagang bar kuning. Garis putus-putus a'pa'piitteang ikatan hidrogen ni bentu' ri sikontu struktura. (B siagang C) Representasi permukaan apolipoprotein siagang struktur cincin seluruhnya, menyoroti oksigen rantai samping L-Phe217 dalam warna biru dan L-Tyr223 dalam warna merah, masing-masing. Subunit L iamintu oren; subunit M siagang H tena na niwarnai. (D siagang E) Apolipoprotein (D) siagang sukku (E) RC QB situs [warna ri (A) massing-massing] siagang Thermophilus thermophilus PSII (hijau, biru siagang quinone plastik; PDB ID: 3WU2) Align (58).
Tena nasanna-sanna, manna pole rie' siapa are struktur QB-deficient RCs tena LH1, mingka anjo pa'pinraang konformasional ni cini'a ri anne pa'pilajaranga anre'pa na'kulle nilaporo' riolo. anne antama tongi struktur depletion QB battu ri Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) siagang Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), yangasenna anjo sanna' sangkamma struktur QBna. Inspeksi dekat 3PRC mengungkapkan bahwa LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) molekul deterjen mengikat di pintu masuk posisi QB, yang dapat mencegah susunan ulang menjadi konformasi tertutup. Manna LDAO tena na ancuru ri posisi yang sama ri 1EYS atau 1OGV, anne RCs nipasadiai ammake deterjen yang sama na jari akkullei appabattu efek yang sama. Struktur kristalna Rba. Sphaeroides RC co-crystallized siagang cytochrome c2 (PDB ID: 1L9B) sanna tongi nia situs QB tertutup. Mingka, ri anne passalaka, daera N-terminal polipeptida RC-M (a'interaksi siagang situs pengikatan QB melalui ikatan H residu Tyr ri heliks Q) angngallei konformasi tenaya na alami, siagang perubahan konformasi QB tena na niparessai pole (30). Apa yang meyakinkan adalah bahwa kita tidak memiliki deformasi seperti ini dari polipeptida M di struktur RC-LH114-W, yang hampir sama dengan daerah N-terminal RC-LH116 RC. Parallu tongi ni issengi punna lebaki ni pa'lanynya' antena LH1 berbasis deterjen, RC apolipoprotein ri PDB ni pa'le'baki, na anre' na'kulle ni pa'le'ba' kolam kinon internal siagang lipid ri celah RC siagang permukaang batinna cincin LH1 ri tammulilina (31, 32). RC tuli a'fungsi nasaba' natahangi ngasengi kofaktor, pantaranganna QB quinone yang dapat diurai, yang kurang stabil dan sering hilang selama proses persiapan (33). Nampa pole, ni isse'mi angkua pa'lappassang LH1 siagang lipid siklik alami battu ri RC akkullei a'jari dampak ri fungsi, pa'pada umuru'na P+QB-state nipisangkai muatan (31, 34, 35). Jari, a'pikkiri angkua rie'na cincin LH1 lokal ri tammulilina RC akkullei ampaentengi situs QB “tertutup”, sa'genna akkullei ampa'jagai lingkungang lokal ri ampi'na QB.
Manna pole apolipoprotein (tena QB quinone) siagang struktur lengkapna a'wakil ruaji gambara'na perputaran situs QB, naia serangkaian kajadian, rie' indikasi angkua anjo pengikatan akkullei ni gerbang untu' anjagai pengikatan ulang ri hidrokinon Untu' antahangi penghambatan substrat. Interaksi quinolol siagang quinone ri ampi'na situs QB apolipoprotein akkullei assisala, na anjari pannangkasia ri RC. Lebba sallo ni usulkan angkua pammopporang konformasi a'kulle a'jari peran ri pa'sambungang siagang pa'kurang quinon. Pakkullena RC beku untu' angngurangi quinones ribokoangna adaptasi sassang ancuru (36); Kristalografi sinar-X ampa'piitteangi angkua anne karugianga nasaba' QB quinones ni tarang ri konformasi “distal” kira-kira 4,5 Å battu ri posisi proksimal aktif (26) , 37). Ikatte assarei saran angkua anne konformasi pengikatan distal iami antu gambara keadaan perantara antara apolipoprotein siagang struktur cincin penuh, yang mengikuti interaksi awal dengan kinon dan pembukaan situs QB.
RC tipe II ni gappa ri kompleks PSII bakteri fototrofik tertentu siagang cyanobacteria, ganggang siagang lamung-lamung nia konservasi struktural siagang fungsional (38). Pa'samaturukang struktural ni pa'piitteang ri gambara 6 (D siagang E) na paentengi sangkamma PSII RCs siagang situs QB kompleks RC bakteri. Anne pa'bandinganga lebba'mi a'jari modele' untu' amparessai sistem pengikatan siagang reduksi quinone yang sanna' siampi'na. Publikasi rioloa ampa'nassai angkua pa'pinraang konformasional ni dampingi siagang reduksi PSII quinones (39, 40). Jari, punna niparhatikang konservasi evolusioner RC, mekanisme pengikatan yang sebelumnya tidak diamati ini mungkin juga berlaku untuk situs QB PSII RC pada tanaman fototrofik beroksigen.
Rps ΔpufW (unlabeled pufW deletion) siagang PufW-His (C-terminal 10x His-tagged protein-W ni ekspresikan battu ri lokus pufW alami) strain. palustris CGA009 ni carita ri jamaang rioloa (16). Anne strain siagang induk tipe liar isogenik niallei battu ri freezer siagang ni garisi sike'de' sel ri PYE (massing-massing 5 g liter -1) (nipantama ri LB ri -80 °C, nia' 50% ( w/v) gliserol) protein, ekstrak ragi siagang suksinat) agar [1.5%/v) piring. Piring ni inkubasi bangngi ri wattu sassanga ri suhu kamar ri kondisi anaerobik, nampa ni singara siagang cahaya kebo (~50 μmolm-2 s-1) ni pasadia ri OSRAM 116-W lampu halogen (RS Components, UK) 3 sa'genna 5 allo sanggenna ammumba se're koloni. Se're koloni nipake untu' inokulasi 10 ml media M22+ (41) nitambai siagang 0,1% (w/v) asam casamino (ribokoangna nikana M22). Kultur ni tanam ri kondisi oksigen rannu ri wattu sassang ri 34°C siagang ni goyang ri 180 rpm 48 jam, nampa 70 ml kultur ni inokulasi ri kondisi yang sama 24 jam. Kultur semi-aerobik siagang volume 1 ml ni pakei untu inokulasi 30 ml media M22 ri 30 ml botolo kaca transparan sekrup universal siagang ni radiasi siagang agitasi (~50μmolm-2 s-1) selama 48 jam siagang gaya magnet steril Stirring rod. Nampa 30 ml kultur ni inokulasi siagang kira-kira 1 liter kultur ilalang kondisi yang sama, nampa nipake untu' inokulasi kira-kira 9 liter kultur ni cahayai ri ~200 μmolm-2 s-1 selama 72 jam. Sel-sel ni panen siagang sentrifugasi ri 7132 RCF 30 menit, ni suspensi poleang ri ~10 ml 20 mM tris-HCl (pH 8.0), siagang ni simpan ri -20°C sanggenna niparalluangi.
Punna lebaki ni cair, tambai siapa are kristal deoksiribonuklease I (Merck, Inggris), lisozim (Merck, Inggris) siagang rua tablet penghambat protease holoenzim Roche (Merck, Inggris) mange ri sel-sel ni gantung poleang. Ri 20.000 psi sel tekanan perancis (Aminco, AS), sel-sel ni ganggu 8 sanggenna 12 kali. Punna lebaki nipasulu sel-sel tenaya na ancuru siagang puing-puing tenaya na larut siagang sentrifugasi ri 18.500 RCF 15 menit ri 4°C, membran ni endapkan battu ri lisa berpigmen siagang sentrifugasi ri 113.000 RCF 2 jam ri 43.000°C. Buang fraksi larut siagang suspensi poleang membran berwarna ri 100 sanggenna 200 ml 20 mM tris-HCl (pH 8.0) siagang homogenisasi sanggenna tena agregat nicini. Membran tersuspensi ni inkubasi ri 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) niaka 2% (w/v) β-DDM selama 1 jam ri laleng sassang ri 4°C siagang aduk lembut. Nampa sentrifugasi ri 70°C untuk nalarutkan 150.000 RCF ri 4°C selama 1 jam untuk ampasuluki sisa-sisa yang tidak larut.
Membran solubilisasi battu ri strain ΔpufW nipakei ri 50 ml kolom pertukaran ion DEAE Sepharose siagang tallu kolom volume (CV) penyangga pengikatan [20 mM tris-HCl (pH 8,0) mengandung 0,03% (w / v) β-DDM]. Basuki kolom siagang rua penyangga pengikatan CV, nampa nu cuci kolom siagang rua penyangga pengikatan niaka 50 mM NaCl. Kompleks RC-LH116 ni elusi siagang gradien linier 150 sa'genna 300 mM NaCl (ri penyangga pengikatan) ri 1,75 CV, siagang sisa kompleks pengikatan ni elusi siagang penyangga pengikatan niaka 300 mM NaCl ri 0,5 CV. Pa'rappungang spektrum absorpsi ri alla'na 250 siagang 1000 nm, pa'jagai fraksi siagang rasio absorpsi (A880/A280) labbi lompo na 1 ri 880 sa'genna 280 nm, encerkan rua-rua ri penyangga pengikatan, siagang pakei pole prosedur yang sama ri kolom DEAE On pemurnian. Encerkanngi fraksi-fraksi siagang rasio A880/A280 tinggiangngang na 1,7 siagang rasio A880/A805 tinggiangngang na 3,0, gaukangi putarang maka tallu pertukaran ion, siagang pa'jagai fraksi-fraksi siagang rasio A880/A280 tinggiangngang na 2,2 siagang rasio A880/A805 tinggiangngang na 2,2. Kompleks yang dimurnikan sebagian dikonsentrasikan hingga ~2 ml dalam Amicon 100.000 berat molekul cut-off (MWCO) filter sentrifugal (Merck, Inggris), dan dimuat di kolom pengecualian ukuran Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, US) mengandung 200 mM penyangga NaCl, dan dielusi di buffer yang sama. CV. Pa'rappungang spektrum absorpsi battu ri fraksi pengecualian ukurang, siagang pa'se'rei spektrum absorpsi siagang rasio A880/A280 labbi 2,4 siagang rasio A880/A805 labbi 5,8 sa'genna 100 A880, siagang langsungi pakei untu' appasadia kisi-kisi cryo-TEM iareka pa'balla'-ballakang Jagai ri -80°C sanggenna niparalluangi.
Membran solubilisasi battu ri strain PufW-His nipakei ri 20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharose kolom (20 mM tris-HCl (pH 8,0) niaka 200 mM NaCl siagang 0,03% (w/w)) ri IMAC buffer (GE Healthcare). v) β-DDM]. Kolom nikanre siagang lima CV penyangga IMAC, nampa siagang lima CV penyangga IMAC niaka 10 mM histidin. Kompleks inti ni eluasi battu ri kolom siagang lima penyangga IMAC niaka 100 mM histidin. Fraksi yang mengandung kompleks RC-LH114-W dikonsentrasikan hingga ~10 ml dalam tangki diaduk yang dilengkapi dengan filter Amicon 100.000 MWCO (Merck, Inggris), diencerkan 20 kali dengan penyangga pengikatan, dan kemudian ditambahkan ke 25 ml Ri kolom DEAE Sepharose, empat penyangga CV yang diikat untuk b di depan. Basuki kolom siagang appa penyangga pengikatan CV, nampa eluasi kompleks ri salapang CV ri gradien linier 0 sa'genna 100 mM NaCl (ri penyangga pengikatan), siagang sisa appa CV niaka 100 mM penyangga pengikatan Kompleks sisa eluasi ri natrium klorida ni pa'se're siagang rasio A888/2008 siagang 2004 labbi tinggi. Rasio A880/A805 tinggiangngang na 4,6 fraksi nikonsentrasi mange ri ~2 ml ri filter sentrifugal Amicon 100.000 MWCO, siagang niisi siagang 1,5 CV IMAC riolo Penyangga seimbang Superdex 200 16/600 kolom pengecualian ukuran, nampa ni elusi ri penyangga yang sama atas CV 1.5.5. Pa'rappungang spektrum absorpsi fraksi ukurang-pengecualian siagang konsentrasikan spektrum absorpsi siagang rasio A880/A280 labbi 2,1 siagang rasio A880/A805 labbi 4,6 sa'genna 100 A880, yang langsung nipake untuk persiapan kisi TEM beku atau disimpan pada -8°C hingga dibutuhkan.
Freezer immersi Leica EM GP ni pakei untuk appasadia kisi-kisi TEM suhu rendah. Kompleks ni encerkan ri IMAC buffer mange ri A880 50, nampa 5μl nipantama ri QUANTIFOIL 1.2/1.3 carbon-coated copper mesh (Agar Scientific, UK). Inkubasi kisi-kisi ri 20°C siagang 60% kelembaban relatif 30 s, nampa nu lappassang 3 s, nampa nu pamatei ri etana cair ri -176°C.
Data kompleks RC-LH114-W ni catat ri eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) siagang mikroskop Titan Krios, yang anjama ri tegangan akselerasi 300kV, siagang pembesaran nominal 130.000× siagang energi celah 200V. Gatan 968 GIF Quantum siagang detektor puncak K2 ni pakei untuk anrekam gambara ri mode pa'bilangan untuk angngalle data. Ukurang piksel yang dikalibrasi adalah 1,048Å, dan tingkat dosis adalah 3,83 e-Å-2s-1. Napasse'rei anjo filma lalang 11 detik nampa nabage a'jari 40 bageang. Pakei area ni lapisi karbon untuk ampa'fokus poleang mikroskop, nampa angngalle tallu film per kali'bong. Sikontu-kontuna, 3130 film ni pa'rappungang, siagang nilai defokus ri alla -1 siagang -3μm.
Data untuk kompleks RC-LH116 ni pa'rappungang ammake mikroskop yang sama ri Laboratorium Biostruktur Asterbury (Universitas Leeds, Inggris). Data ni pa'rappungang ri mode bilangang siagang pembesaran 130 k, siagang ukurang piksel ni kalibrasi mange ri 1,065 Å siagang dosis 4,6 e-Å-2s-1. Anjo film ni rekam lalang 12 detik siagang ni bage 48 bageang. Sikontu-kontuna, 3359 film ni pa'rappungang, siagang nilai defokus ri alla -1 siagang -3μm.
Sikontu pammodelang data nigaukangi ri pipeline Relion 3.0 (42). Pakei Motioncorr 2 (43) untuk ampakabajiki gerakang balok siagang dosis pembobotan, nampa pakei CTFFIND 4.1 (44) untuk ampattantui CTF (fungsi transfer kontras) parameter. Fotomikrograf biasa ribokoangna tahap pemrosesan pammulang ni pa'piitteang ri gambara 2. S16. Templat pammileang otomatis ni paentengi siagang ammile secara manual kira-kira 250 piksel 1000 partikel ri bingkai 250 piksel siagang tena referensi klasifikasi dua dimensi (2D), jari na tolak anjo klasifikasi yang anrapikang kontaminasi sampel atau tena sipa'na. Nampa, pappileang otomatis nigaukangi ri sikontu mikrofoto, siagang RC-LH114-W iamintu 849.359 partikel, siagang kompleks RC-LH116 iamintu 476.547 partikel. Sikontu partikel nipilea lebba'mi allalo rua putarang non-referensi 2D klasifikasi, siagang ribokoangna massing-massing lari, partikel yang assibuntulu' siagang area karbon, kontaminasi sampel, tena fitur yang jelas atau partikel yang kuat tumpang tindih ni tolak, na wassele'na 772.033 (90.9%) siagang 359.678 (75.55 ) partikel ni pake untuk klasifikasi 3D 3D ni pake. RC-LH114-W siagang RC-LH116 massing-massing. Model referensi 3D pammulang ni paentengi siagang metode penurunan gradien stokastik. Ammake modele pammulang salaku referensi, partikel nipilea nipantama ri appa kategori ri 3D. Pakei modele ri anne kategoria salaku referensi, gaukangi 3D refining ri partikel-partikel ri kategori kaminang lompoa, nampa pakei filter low-pass 15Å pammulang untu' antongkoki area pelarut, tambai 6 piksel tepi le'leng, siagang pasca-proses piksel untu' ampakabajiki fungsi transfer Modulasi puncak Gatan K2 detektor atas. Untuk dataset RC-LH114-W, modele pammulang anne nipinrai siagang nipelaki kepadatan kuat ri cappa masker (ni putuskan battu ri kepadatan kompleks inti ri UCSF Chimera). Model yang dihasilkan (resolusi RC-LH114-W dan RC-LH116 adalah 3,91 dan 4,16 Å, masing-masing) digunakan sebagai referensi untuk putaran kedua klasifikasi 3D. Partikel yang digunakan dikelompokkan ke dalam kelas 3D awal dan tidak mengandung korelasi kuat dengan lingkungan. Tumpang tindih atau kurangnya fitur struktural yang jelas. Punna lebaki putaran kedua klasifikasi 3D, kategori siagang resolusi tinggi nipilei [Untuk RC-LH114-W, se're kategori iamintu 377.703 partikel (44,5%), untuk RC-LH116, rie' rua kategori, sanna' jaina 260.752 partikel (54,7% Wh), punna iaji bawang ni se're ribokoang. rotasi pammulang siagang sisalana ca'di]. Partikel-partikel nipilea ni ekstrak poleang ri kotak 400-piksel siagang ni haluskan siagang 3D refining. Masker pelarut ni paentengi ammake filter low-pass 15Å pammulang, ekspansi peta 3 piksel siagang masker lembut 3 piksel. Pake per-partikel CTF penyempurnaan, per-partikel perbaikan gerakan siagang putaran kedua per-partikel CTF penyempurnaan, penyempurnaan 3D, penyamaran pelarut siagang pasca-pemrosesan nigaukangi ribokoangna massing-massing langkah untu' ampa'jari bajiki pole tekstur nu'kullea. Pake FSC (Koefisien Korelasi Cangkang Fourier) nilai cut-off 0,143, resolusi modele akhir RC-LH114-W siagang RC-LH116 iamintu 2,65 siagang 2,80Å, massing-massing. Kurva FSC modele paccappureng ni pa'piitteang ri gambara 2. S17.
Sikontu urutan protein ni unduh battu ri UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) ni pakei untu ambangung modele homologi RC, yang nia urutan protein RC-L, RC-M siagang RC-H siagang struktur kristal Rba. sphaeroides RC ni pakei salaku template (PDB ID: 5LSE) (46). Pakei alat “peta cocok” ri UCSF Chimera untu’ ampa’cocoki modele’ ni pa’jaria mange ri peta (47), ampa’jari bajiki struktur protein, siagang kofaktor [4×BChl a (areng residu perpustakaan monomer = BCL), 2×BPh a (BPH), se’re yareka rua rupanna UQ10 (U10), se’re besi non-heme (Fe) siagang se’re heksadikarilin,34 (QAK)] pakei Coot (48) untuk a'tambai. Nasaba QAK tena na rie' ri perpustakaan monomer, iami antu niparameterkangi ammake alat eLBOW ri PHENIX (49).
Nampa, subunit LH1 nibangung. Riolo, alat konstruksi otomatis ri PHENIX (49) ni pakei untuk konstruksi otomatis bageang urutan LH1 ammake peta siagang urutan protein LH1-α siagang LH1-β salaku input. Pilei subunit LH1 yang paling lengkap, ekstrak dan muat ke Coot, secara manual menambahkan urutan yang hilang di dalamnya, dan secara manual menyempurnakan seluruh struktur sebelum menambahkan dua BCls a (BCL) dan sebuah spirilloxanthin (CRT) [menurut Rps yang relevan Kepadatan kompleks LH1 dan kandungan karotenoid yang diketahui. Spesies (17)]. Salin subunit LH1 lengkap, siagang pakei UCSF Chimera “Docking Map Tool” untu’ a’dongko’ ri area non-model ri ampi’na kepadatan LH1, nampa nupa’jari baji’ ri Coot; ulangi anjo prosesna sanggenna sikontu subunit LH1 lebaki ni modele. Untuk struktur RC-LH114-W, siagang ekstraksi kepadatan yang tidak dialokasikan di Coot, protein dibagi dari sisa komponen non-protein di peta Chimera USCF dan alat Autobuild digunakan untuk membangun model awal, dan sisa subunit (protein-W) Pemodelan. Ri PHENIX (49). Tambahkangi urutan yang kurang pada model yang dihasilkan di Coot (48), dan kemudian manual menyempurnakan seluruh subunit. Densitas yang tidak dialokasikan yang tersisa cocok dengan kombinasi lipid (ID perpustakaan monomer PDB dari CDL = CDL, POPC = 6PL dan POPG = PGT), deterjen β-DDM (LMT) dan molekul UQ10 (U10). Pakei optimasi PHENIX (49) siagang optimasi manual ri Coot (48) untuk ampa bajiki modele pammulang lengkap sanggenna statistik modele siagang kualitas visual pas anre' na'kulle ni pa'jari baji'. Paccappurenna, pakei LocScale (50) untu' ampa'jari peta lokal, nampa nugaukang siapa are siklus maraeng untu' a'modele' densitas tenaya na'kulle nisare siagang optimasi otomatis siagang manual.
Peptida, kofaktor siagang lipid siagang quinon maraengannaya nipantama ri laleng kepadatanna massing-massing ni pa'piitteang ri gambara 1 siagang 2. S18 sanggenna S23. Informasi statistik modele paccappureng ni pa'piitteang ri tabel S1.
Punna tena na nipau maraeng, spektrum absorpsi UV/Vis/NIR nipasse'rei ri spektrofotometer Cary60 (Agilent, USA) ri interval 1 nm battu ri 250 nm sanggenna 1000 nm siagang wattu integrasi 0,1s.
Encerkan sampel ri kuvet kuarsa siagang jalur 2 mm mange ri A880 battu ri 1, siagang pa'rappungang spektrum absorpsi antara 400 siagang 1000 nm. Spektrum dikroik lingkaran ni pa'rappungang ri spektropolarimeter Jasco 810 (Jasco, Jepang) ri interval 1 nm ri alla'na 400 nm siagang 950 nm ri laju pindai 20 nm min-1.
Koefisien kepunahan molar ni tentukan siagang ni encerkan kompleks inti mange ri A880 kira-kira 50. Encerkan volume 10 μl ri 990 μl penyangga pengikatan atau metanol, siagang pa'rappungang spektrum absorpsi langsung untuk meminimalkan degradasi BChl. Kandungan BChl ri massing-massing sampel metanol nirekengi siagang koefisien kepunahan ri 771 nm 54,8 mM-1 cm-1, siagang koefisien kepunahan ni tentukan (51). Bagei konsentrasi BChl ni ukkuru siagang 32 (RC-LH114-W) atau 36 (RC-LH116) untuk ampattantui konsentrasi kompleks inti, nampa nipake untu ampattantui spektrum absorpsi sampel yang sama yang dikumpulkan dalam koefisien Kepunahan penyangga. sipakaturu. Tellu pa'ukkuru' niulangi ni allei untuk massing-massing sampel, siagang absorbansi rata-rata BChl Qy maksimum ni pakei untuk pa'bilangan. Koefisien kepunahan RC-LH114-W ni ukkuru ri 878 nm iamintu 3280±140 mM-1 cm-1, sementara koefisien kepunahan RC-LH116 ni ukkuru ri 880 nm iamintu 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 ni ukkuru situru metode ri (52). Singkatna, HPLC fase balik (RP-HPLC) nigaukangi ammake sistem HPLC Agilent 1200. Larutkan kira-kira 0,02 nmol RC-LH116 atau RC-LH114-W dalam 50μl 50:50 metanol:kloroform mengandung 0,02% (w/v) besi klorida, dan suntikkan pra-seimbang Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4mml Larutkan pada 1-1-ml. 40°C ri pelarut HPLC (80:20 metanol:2-propanol) ri kolom ×25 cm. Gaukangi elusi isokratik ri pelarut HPLC untuk angngawasi absorbansi ri 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoid) siagang 780 nm (BChl) selama 1 jam. Puncak ri 275 nm kromatogram ri 25,5 menit ni integrasikan, yang tena na rie' senyawa maraeng yang akkulle ni deteksi. Area terpadu ni pakei untu' anghitung jumlah molar UQ10 ni ekstrak siagang referensi kurva kalibrasi ni hitung battu ri injeksi standar murni battu ri 0 sanggenna 5,8 nmol (Gambara S14). massing-massing sampel ni analisisi ri tallu replika, siagang kasalaang ni laporo sicocoki siagang SD rata-rata.
Larutan niaka kompleks RC-LH1 siagang absorpsi Qy maksimal 0,1 nipasadiai siagang 30 μM sitokrom jantung kuda c2 (Merck, Inggris) siagang 0 sa'genna 50 μMUQ2 (Merck, Inggris). Tellu sampel 1-ml nipasadia ri massing-massing konsentrasi UQ2 siagang ni inkubasi sibulang ri sassanga ri 4°C untuk ampa'tantui adaptasi sukku' ri sassanga riolo ri wattu ni ukkuru. Larutan nipantama ri OLIS RSM1000 spektrofotometer modular ni pasadia siagang 300 nm api/500 kisi garisi, 1,24 mm antama, 0,12 mm tangnga siagang 0,6 mm celah assulu. Filter 600 nm long pass nipadongko ri pakkebuka tabung foto sampel siagang tabung fotomultiplier referensi untuk anre' na cahaya eksitasi. Absorbansi ni pantau ri 550 nm siagang wattu integrasi 0,15 s. Cahaya eksitasi nipasulu battu ri 880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) ilalang kabel serat optik ri intensitas 90% ilalang DC2200 controller (Thorlabs Ltd., UK) siagang nipasulu mange ri sumber cahaya ri sudu 90°. Balok pengukuran berlawanan dengan cermin untuk membalikkan cahaya yang tidak diberikan pada awalnya oleh sampel. Pantaui absorbansi 10 s riolo ri tenanapa na 50 s. Nampa absorbansi nipantamaki pole 60 s ri sassanga untu' ansalidiki antekamma batena quinolol spontan nakurangi sitokrom c23 + (ciniki gambara S8 untuk data mentah).
Data ni proses siagang ni pasangi laju pammulang linier lalang 0,5 sanggenna 10 s (tagannakkang ri konsentrasi UQ2) siagang ni rata-ratai laju battu ri tallu sampel ri massing-massing konsentrasi UQ2. Konsentrasi RC-LH1 nirekeng ri koefisien kepunahan massing-massing nipake untu' a'pinra laju anjari efisiensi katalitik, ni plot ri Origin Pro 2019 (OriginLab, USA), siagang nipasang ri modele Michaelis-Menten untu' ampattantui nilai Km siagang Kcat.
Untuk pengukuran penyerapan sementara, sampel RC-LH1 diencerikan hingga ~2μM dalam penyangga IMAC yang mengandung 50 mM natrium askorbat (Merck, USA) dan 0,4 mM Terbutin (Merck, USA). Asam askorbat ni pakei salaku donor elektron pengorbanan, siagang tert-butaclofen ni pakei salaku inhibitor QB untuk memastikan donor RC utama tettei ni kurangi (iamintu, tena na fotooksidasi) lalang sikontu proses pangukurang. Kira-kira 3 ml sampel nitambai mange ri sel a'pinra khusus (kira-kira 0,1 m diameterna, 350 RPM) siagang 2 mm la'buna jalur optik untu' ampa'nassai angkanaya sampel ri jalur laser nia' wattu sukku'na untu' adaptasi sassang ri alla'na pulsa eksitasi. Pakei pulsa laser ~100-fs untuk ampakajarreki sistem laser Ti: Sapphire (Spectra Physics, USA) untuk ampaentengi sampel ri 880 nm ri laju pengulangan 1 kHz (20 nJ untuk NIR atau 100 nJ untuk Vis). Riolo angngalle data, pa'piitteang sampel ri cahaya eksitasi kira-kira 30 menit. Paparan akan menyebabkan inaktivasi QA (mungkin mengurangi QA sekali atau dua kali). Mingka parallui nu u'rangi angkua anne prosesa akkullei nipinra nasaba' punna le'ba'mi wattu la'bu adaptasi sassang, RC la'jari lambat-lambat ammotere' mange ri kegiatan QA. Spektrometer Helios (Ultrafast Systems, USA) ni pakei untu angngukuri spektrum transient siagang wattu penundaan -10 sanggenna 7000 ps. Pakei perangkat lunak Surface Xplorer (Ultrafast Systems, USA) untuk ampa'le'baki data set, nampa a'se're siagang a'pa'se're. Pakei paket perangkat lunak CarpetView (Light Conversion Ltd., Lithuania) untuk ampakei data gabungan untuk anggappa spektrum diferensial terkait peluruhan, atau menggunakan fungsi yang menggabungkan eksponen berganda dengan tanggapan instrumen untuk menyesuaikan evolusi spektral panjang gelombang tunggal di Origin (OriginLab, USA).
Sangkamma lebaka nipau ri dallekang (53), film fotosintesis niaka kompleks LH1 tenaya RC siagang antena LH2 perifer nipasadiai. Membran ni encerkan ri 20 mM tris (pH 8.0) nampa nipantama ri kuvet kuarsa siagang jalur optik 2 mm. Pulsa laser 30nJ nipakei untu' ampa'jari sampel ri 540 nm siagang wattu pa'tundaang -10 sa'genna 7000 ps. Proses data set sangkamma ni carita untuk Rps. pal sampel.
Membran ni pelet siagang sentrifugasi ri 150.000 RCF 2 jam ri 4°C, nampa absorbansi ri 880 nm ni suspensi ammotere ri 20 mM tris-HCl (pH 8.0) siagang 200 mM NaCl. Larutkangi membrana siagang lambat-lambat ni aduk 2% (w/v) β-DDM selama 1 jam ri sassanga ri 4°C. Sampel ni encerkan ri 100 mM triethylammonium carbonate (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) mange ri konsentrasi protein 2.5 mg ml-1 (analisis Bio-Rad). Pamprosesang lanjutang nigaukangi battu ri metode lebba ni pa'nassai (54), appakkaramula siagang pengenceran 50 μg protein anjari 50 μl TEAB niaka 1% (w/v) natrium laurat (Merck, UK). Punna lebaki sonikasi 60 s, ni kurangi siagang 5 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (Merck, UK) ri 37°C 30 menit. Untuk S-alkilasi, inkubasi sampel siagang 10 mM metil S-metilthiometanasulfonat (Merck, Inggris) siagang tambai battu ri larutan stok isopropanol 200 mM 10 menit ri suhu kamara. Pencernaan proteolitik nigaukangi siagang nitambai 2 μg campuran trypsin/endoproteinase Lys-C (Promega UK) siagang ni inkubasi ri 37°C 3 jam. Surfaktan laurat niekstraksi siagang nitambai 50 μl etil asetat siagang 10 μl 10% (v/v) asam trifluoroasetat kelas LC (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) siagang ni vortexing 60 s. Pemisahan fase ni promosikan siagang sentrifugasi ri 15.700 RCF selama 5 menit. Situru protokol pa'pareka, kolom spin C18 (Thermo Fisher Scientific, UK) ni pakei untu' aspirasi siagang desalt baji'-baji' fase rawaya niaka peptida. Punna lebaki ni keringkan siagang sentrifugasi vakum, sampel ni larutkan ri 0,5% TFA siagang 3% asetonitril, siagang 500 ng ni analisisi siagang kromatografi nanoflow RP ni pasang siagang spektrometri massa ammake parameter sistem yang ni rincikan riolo.
Pakei MaxQuant v.1.5.3.30 (56) untuk identifikasi siagang kuantifikasi protein untuk amboyai Rps. database proteome palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Data proteomik spektrometri massa lebba nipantama ri ProteomeXchange Alliance ilalang repositori mitra PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) irawanganna pengidentifikasi dataset PXD020402.
Untuk analisis RPLC ni pasang siagang spektrometri massa ionisasi elektrospray, kompleks RC-LH1 nipasadiai battu ri Rps tipe liar. Pake metode yang lebba ni pa'nassai (16), konsentrasi protein ni paenteng ri sel palustris iamintu 2 mg ml-1 ri 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl siagang 0.03% (w/v) β- (analisis Bio-Rad) ) DDM. Situru protokol pabrik, pakei kit pemurnian 2D (GE Healthcare, USA) untuk angngalle 10 μg protein siagang metode presipitasi, siagang larutkan presipitasi ri 20 μl 60% (v / v) asam format (FA), 20% (v / v) Asetonitril siagang 20% ​​(v/v) je'ne'. Lima mikroliter ni analisis siagang RPLC (Dionex RSLC) ni pasang siagang spektrometri massa (Maxis UHR-TOF, Bruker). Pakei MabPac 1.2×100 mm kolom (Thermo Fisher Scientific, UK) untuk pemisahan ri 60°C siagang 100μlmin -1, siagang gradien 85% (v / v) pelarut A [0.1% (v / v) FA siagang 0.02% (V/v) TFA larutan berair] mange ri pelarut 85% Bv/v) [0.1%(v/v) FA siagang 0.02%(v/v) ri 90%(v/v) asetonitril TFA] Pake sumber ionisasi elektrospray standar siagang parameter default labbi 60 menit, spektrometer massa anggappai 100 sa'genna 2750 m/z (rasio massa-muatan). siagang bantuang portal sumber daya bioinformatika ExPASy FindPept tool (https://web.expasy.org/findpept/), peta spektrum massa mange ri subunit kompleks.
Sel-sel ni tumbuh 72 jam ri yawa 100 ml NF-low (10μMm-2 s-1), medium (30μMm-2 s-1) atau tinggi (300μMm-2 s-1) cahaya. M22 medium (M22 medium di mana amonium sulfat dihilangkan dan natrium suksinat diganti dengan natrium asetat) dalam botol 100 ml sekrup-top (23). Ri lima siklus 30-s, manik-manik kaca 0,1 mikron ni manik-manik ri rasio volume 1:1 untuk lisis sel-sel siagang ni dinginkan ri es selama 5 menit. Bahan yang tidak larut, sel yang tidak pecah dan manik-manik kaca dilepaskan dengan sentrifugasi pada 16.000 RCF selama 10 menit dalam mikrosentrifugal bangku. Membran nipisangkai ri Ti 70.1 rotor siagang 100.000 RCF ri 20 mM tris-HCl (pH 8.0) siagang 40/15% (w/w) gradien sukrosa 10 jam.
Sangkamma ni carita ri jamaang rioloa, imunodeteksi tag His ri PufW (16). Singkatna, kompleks inti yang dimurnikan (11,8 nM) atau membran yang mengandung konsentrasi RC yang sama (nitentukan dengan oksidasi mengurangi spektrum perbedaan yang dikurangi dan mencocokkan beban pada gel yang diwarnai) dalam 2x penyangga pemuatan SDS (Merck, UK) diencerkan dua kali. Protein nipisangkai ri replika 12% bis-tris NuPage gel (Thermo Fisher Scientific, UK). Se're gel niwarnai siagang Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) untuk antama siagang ampa'cinikang subunit RC-L. Protein ri gel maka ruaya nipaletteki mange ri membran poliviniliden fluorida (PVDF) diaktifkan metanol (Thermo Fisher Scientific, UK) untuk immunoassay. Membran PVDF niblokir ri 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (v/v) Tween-20 siagang 5% (w/v) susu bubuk skim, nampa ni inkubasi siagang antibodi primer anti-His (ri penyangga antibodi encer [50 mM-HCl) 7.6), 150 mM NaCl siagang 0.05% (v/v) Tween-20] ri 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) 4 jam. Punna lebaki ni cuci 3 pissang 5 menit ri penyangga antibodi, membran ni passe'rei siagang antibodi sekunder anti-tikus horseradish peroksidase (Sigma-Aldrich, Inggris) (ni encerkan 1:10.000 ri penyangga antibodi) Inkubasi untuk memungkinkan deteksi (5 menit setelah 3 cuci dalam penyangga antibodi) menggunakan WAR EST 2000. substrat chemiluminescence (Cyanagen, Italia) siagang Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Inggris).
siagang a'gambara distribusi intensitas massing-massing gel berwarna atau jalur imunoassay, mengintegrasikan area di bawah puncak dan menghitung rasio intensitas RC-L (gel berwarna) dan Protein-W (immunoassay), di ImageJ (57) Proses gambara. Rasio-rasio anne nipinrai ajari rasio molar siagang ni anggappai rasio RC-L mange ri protein-W ri sampel RC-LH114-W murni iamintu 1:1 siagang ni normalisasi ngasengi data set situru.
Untuk bahan tambahan untuk artikel ini, silahkan lihat http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
anne iami antu artikel akses terbuka ni distribusikan ri yawana paratorang lisensi atribusi creative commons. Anne artikela akkullei nipake, nipa'bageang, siagang nipa'jari poleang ri media apa-apa mamo ilalang kondisi karya aslina ni kutip baji'-baji'.
Catatang: Ikatte appalakki bawang ri kau sollanna nupassareang alamat emailnu sollanna tau nu rekomendasikan mange ri halamanga naisse'i angkanaya ero'nu nacini' emailnu siagang teai spam. Ikatte tena na la angngalle alamat email.
anne pakkuta'nang ni pakei untu' anuji punna ikatte tau battu siagang anjagai pa'sareang spam otomatis.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirma, Hicoil, Necoil Hunter.
Struktur resolusi tinggi kompleks perangkap cahaya 1 ri pusat reaksi assarei pa'pahang beru ri sesena dinamika quinone.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirma, Hicoil, Necoil Hunter.
Struktur resolusi tinggi kompleks perangkap cahaya 1 ri pusat reaksi assarei pa'pahang beru ri sesena dinamika quinone.
©2021 Asosiasi Amerika untuk Kemajuan Sains. sikontu ha'na nijaga. AAAS iami antu pa'samaturukang HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef siagang COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.